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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111676251A(43)申请公布日2020.09.18(21)申请号201911416616.6C12N15/70(2006.01)(22)申请日2019.12.31(71)申请人上海仁酶生物科技有限公司地址201321上海市浦东新区康新公路3399弄26号216室申请人南京趣酶生物科技有限公司(72)发明人林涛徐明文蒋丽丽曹学松(74)专利代理机构南京正联知识产权代理有限公司32243代理人陈斐(51)Int.Cl.C12P7/42(2006.01)C12P7/24(2006.01)C12N9/10(2006.01)C12N9/02(2006.01)权利要求书2页说明书5页序列表7页附图1页(54)发明名称应少,后处理简便,总收率高,可达25%;反应时间一种咖啡酸和香兰素的制备方法及其反应短,全部过程在72-96h内完成。催化剂的制备方法(57)摘要本发明公开了一种咖啡酸和香兰素的生物制造方法,第一步以葡萄糖等为起始原料,通过大肠杆菌菌种,发酵生产中间体3-脱氢莽草酸,中间体的浓度大于50g/L,糖质量转化率(A/G)为30-40%,可达到最大的理论转化率;第二步采用酶催化过程,通过自主开发合适的酶,以发酵过程获得的3-脱氢莽草酸为原料,生物酶催化得到中间体原儿茶酸;第三步采用酶催化过程,通过自主开发合适的酶,以前一步获得的原儿茶酸为原料,生物酶催化得到中间体咖啡酸;第四步采用酶催化过程,通过自主开发合适的酶,以前一步获得的咖啡酸为原料,生物酶催化得到产品香兰素。整个过程采用一步发酵加三步生物酶催化,合成产品香兰素。本发明的有益效果:以葡萄糖为原料,其价格实惠,来源广泛,而且整个工艺得到了简化,产物浓度高,可达到20-80g/L,降低CN111676251A香兰素的生产成本且减少环境污染;本路线副反CN111676251A权利要求书1/2页1.一种制备咖啡酸的方法,具体步骤如下:步骤一:通过发酵方法获得3-脱氢莽草酸原料的方法,即采用天然来源糖进行微生物合成该原料的过程;步骤二:将葡萄糖发酵得到3-脱氢莽草酸,进而使用3-脱氢莽草酸脱水酶催化剂催化得到原儿茶酸;步骤三:将步骤二得到的原儿茶酸溶解并加入磷酸盐,调整pH到6-11,加入邻甲基转移酶催化剂(OMT)和辅助因子S-腺苷甲硫氨酸(SAM);步骤四:将步骤三中的反应体系在25-40℃下恒温搅拌,反应16-24小时,得到咖啡酸。2.一种香兰素的制备方法,具体步骤如下:步骤一:通过发酵方法获得3-脱氢莽草酸原料的方法,即采用天然来源糖进行微生物合成该原料的过程;步骤二:将葡萄糖发酵得到3-脱氢莽草酸,进而使用3-脱氢莽草酸脱水酶催化剂催化得到原儿茶酸;步骤三:向步骤二的反应体系中加入邻甲基转移酶催化剂(OMT)和辅助因子SAMS-腺苷甲硫氨酸,催化得到咖啡酸体系液;步骤四:将步骤三的反应体系中加入芳香族羧酸还原酶催化剂(ACAR)和辅助因子NAD,在25-40℃下恒温搅拌,反应16-24小时,催化得到香兰素。3.权利要求1中邻甲基转移酶催化剂的制备方法,具体步骤如下:步骤一:将邻甲基转移酶(o-methyltransferase,OMT)片段重组到pET21a载体上,阳性重组质粒-pET21a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3),得到原核表达菌株pET21a(+)/BL21(DE3);步骤二:将上述表达菌株在加有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的5mLLB液体培养基中于37℃、200rpm振荡培养过夜后,按1%(V/V)比例接种于含有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的500mLLB液体培养基中,于37℃、200rpm振荡培养,待OD600在0.8-1.0之间时,加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,IPTG),并在25℃诱导过夜;步骤三:将步骤二所得液在8000rpm条件下离心收集,然后悬浮于50mMpH7.0磷酸钠缓冲液中,超声破碎(200W,3s/5s,10min),4℃,8000rpm离心20min,得到邻甲基转移酶催化剂(OMT)。4.根据权利要求3所述的邻甲基转移酶催化剂的制备方法,其特征在于:所述步骤二中的培养基包括:10g/L胰蛋白胨(OXIOD),5g/L酵母粉(OXIOD),10g/L氯化钠(国药试剂)。5.权利要求2中芳香族羧酸还原酶催化剂(ACAR)的制备方法,具体步骤如下:步骤一:将芳香族羧酸还原酶(ACAR)分别重组到pET21a载体上,阳性重组质粒-pET21a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3),得到原核表达菌株pET21a(+)/BL21(DE3);步骤二:将上述表达菌株在加有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的5mLLB