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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111999491A(43)申请公布日2020.11.27(21)申请号202010871560.X(22)申请日2020.08.26(71)申请人深圳容金科技有限公司地址518000广东省深圳市宝安区航城街道三围社区航城智慧安防科技园A栋7层7777号(72)发明人邓兴朝陈欢甘筱静林金昌曾祥富(74)专利代理机构深圳市深坪知识产权代理事务所(普通合伙)44586代理人李想(51)Int.Cl.G01N33/543(2006.01)G01N33/53(2006.01)权利要求书2页说明书9页附图1页(54)发明名称一种氧氟沙星检测试剂盒及其检测方法(57)摘要本发明涉及免疫学技术和食品安全检测技术领域,公开了一种氧氟沙星检测试剂盒,所述氧氟沙星试剂盒包含试剂:96孔氧氟沙星酶标板;氧氟沙星标准品:0、0.1、0.25、0.5、1、5ng/mL,回收用100ng/mL;10x氧氟沙星抗体;抗体稀释液;酶标二抗;10x样本提取液;20x浓缩洗液;终止液和TMB底物。本发明的氧氟沙星检测试剂盒及其检测方法,可用于食品检测行业中氧氟沙星含量的检测,测定准确、灵敏、特异性好、重现性好、操作简单、样本前处理简单、成本低、检测量大、绿色环保、检测速度快并且易于推广,本发明制备出的氧氟沙星检测试剂盒检测限低,可达0.1ng/mL,灵敏度高,板内和板间变异系数均小于10%,样本添加回收率在89.3%‑114.8%,与其他类似物的交叉反应均较低。CN111999491ACN111999491A权利要求书1/2页1.一种氧氟沙星检测试剂盒,其特征在于:所述氧氟沙星试剂盒包含试剂:96孔氧氟沙星酶标板;氧氟沙星标准品:0、0.1、0.25、0.5、1、5ng/mL,回收用100ng/mL;10x氧氟沙星抗体;抗体稀释液;酶标二抗;10x样本提取液;20x浓缩洗液;终止液和TMB底物;所述氧氟沙星试剂盒的制备方法包括以下步骤:①包被:将包被原用包被液适当稀释,100uL抗原稀释液/孔来包被96孔氧氟沙星酶标板,4℃过夜;②洗涤:用浓缩洗液洗板3次,拍干;③封闭:用封闭液进行封闭,每孔180uL,37℃封闭1.5h;④干燥:取出酶标板,倾去孔内液体,吸水纸上拍干,对酶标板进行真空干燥,贴好封板膜,便于保存。2.根据权利要求1所述的一种氧氟沙星检测试剂盒,其特征在于:所述包被液为0.05MPH9.6的碳酸盐缓冲液(CBS),所述封闭液为1%BSA+10%蔗糖。3.根据权利要求1所述的一种氧氟沙星检测试剂盒,其特征在于:所述浓缩洗液为1xPBST,所述浓缩洗液含0.05%Tween-20,所述1x样本提取液为10xPBS缓冲液。4.根据权利要求1所述的一种氧氟沙星检测试剂盒,其特征在于:所述终止液为1M硫酸,所述TMB为四甲基联苯胺。5.根据权利要求3所述的一种氧氟沙星检测试剂盒,其特征在于:所述PBS缓冲液由二水合磷酸二氢钠0.39g、十二水磷酸氢二钠5.54g、NaCL8.5g和蒸馏水定容至1L而成。6.一种氧氟沙星检测试剂盒的检测方法,其特征在于:采用间接竞争ELISA法检测,操作步骤如下:①加入50uL的标准液或样品于所设定的孔中;②在每孔中加入50μL酶标二抗,再加入50μL1X氧氟沙星抗体,混匀1分钟;③室温(25℃)避光孵育30分钟;④洗板5次,每次加入300μL工作洗液,最后一次洗板尽量甩干并在吸水纸上吸干;⑤加入100uL的TMB底物;⑥加入底物后立即计时,轻敲试剂盒三秒使混匀;⑦在室温下培养15分钟,加入100uL的终止液终止反应,在450m下读0D值。7.根据权利要求6所述的一种氧氟沙星检测试剂盒及其检测方法,其特征在于:所述间接竞争ELISA方法的建立:一、最佳抗原包被稀释度、单克隆抗体稀释度的确定:棋盘法确定最适抗原包被稀释度,氧氟沙星标准品质量浓度使用0ng/mL,抗原液稀释倍数:10000、20000、40000;单克隆抗体液稀释倍数:10000、20000、40000、80000;酶标二抗为羊抗鼠IgG-HRP,稀释倍数为3000,将包被抗原不同稀释倍数酶标板用不同稀释倍数的单克隆抗体和酶标二抗进行配合使用,筛选出吸光度在1.8-2.2左右所对应的浓度为包被抗原、抗体和酶标二抗最佳工作浓度;二、氧氟沙星标准品浓度的确定:测不同浓度氧氟沙星标准品溶液(0-100ng/mL),初步确定线性范围,再根据结果细致缩小范围,通过不同浓度的尝试,绘制出标准曲线线性最好的一组浓度作为氧氟沙星试剂盒的最终标准品浓度。8.根据权利要求6所述的一种氧氟沙星检测试剂盒及其检测方法,其特征在于:所述2CN111999491A权利要求书2/2页TMB底物本身是无色的,若出现颜