一种双水相萃取纯化核酸酶P1的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112175920A(43)申请公布日2021.01.05(21)申请号202011158223.2(22)申请日2020.10.26(71)申请人南京工业大学地址211816江苏省南京市浦口区浦珠南路30号申请人南京同凯兆业生物技术有限责任公司(72)发明人陈晓春张磊汤亦文李梓阳(74)专利代理机构江苏圣典律师事务所32237代理人肖明芳(51)Int.Cl.C12N9/22(2006.01)权利要求书1页说明书7页附图1页(54)发明名称一种双水相萃取纯化核酸酶P1的方法(57)摘要本发明涉及生物领域，具体公开了一种双水相萃取纯化核酸酶P1的方法，用含有聚乙二醇和核苷酸二钠盐水溶液的双水相混合液从含有核酸酶P1的粗酶液中萃取纯化核酸酶P1。本本发明方法能够高效的分离纯化核酸酶P1，核酸酶P1的酶回收率达87.6％；而且成本低廉、可适用于大规模产业化生产。另外，本发明方法所获得的核酸酶P1纯度大大提高，比活比粗酶提高4.6倍、杂质少，所以可用于食品工业。同时，双水相成分PEG和核苷酸二钠均可回收利用，大大降低成本。CN112175920ACN112175920A权利要求书1/1页1.一种双水相萃取纯化核酸酶P1的方法，其特征在于，用含有聚乙二醇和核苷酸二钠盐水溶液的双水相混合液从含有核酸酶P1的粗酶液中萃取纯化核酸酶P1。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的聚乙二醇分子量为1000～5000。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核苷酸二钠为鸟苷酸二钠、腺苷酸二钠、肌苷酸二钠、尿苷酸二钠和胞苷酸二钠中的任意一种或几种组合。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的双水相混合液中，聚乙二醇、核苷酸二钠盐和水的质量百分比为20～35:25～40:30～50。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有核酸酶P1的粗酶液为桔青霉发酵所制得的；其中，所述的桔青霉(Penicilliumcitrinum)已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.2014。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有核酸酶P1的粗酶液中核酸酶P1的酶活为4000～6000U/mL。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的双水相混合液与含有核酸酶P1的粗酶液的质量比为0.5～1:1。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将双水相与含有核酸酶P1的粗酶液混合后，调节pH为5.0～8.0，静置，收集上层液相；将上层液相稀释后，用超滤膜超滤，所得截留物即为纯化的核酸酶P1。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的静置为室温静置10min。10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的超滤膜为聚醚砜膜，分子量为10～30KDa。2CN112175920A说明书1/7页一种双水相萃取纯化核酸酶P1的方法技术领域[0001]本发明涉及生物领域，具体涉及一种双水相萃取纯化核酸酶P1的方法。背景技术[0002]5'-核苷酸已广泛应用于食品、生化工业以及制药工业。在食品行业中，己经由最初的食品助鲜剂扩展为具有提高生物体免疫功能的功能性食品添加剂，可以添加在面包、饼干等食品中，尤其在婴幼儿食品中的使用效果非常明显，能够有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢疾的能力，减少腹泻的发生。在医药领域，5'-核苷酸不但能够作为药物使用，而且还是许多抗病毒抗肿瘤药物的生产原料。此外，核苷酸制剂还可以作为动植物生长调节剂，有着明显的增产、增重功效。[0003]在酶解法制备核苷酸中所需的酶是核酸酶Pl，它是一种能够水解RNA获得四种5'-核苷酸的磷酸二酯酶，其酶解产物杂质少后续分离工艺简单，国外一般采用该方法进行核苷酸的生产。但是核酸酶P1粗酶含有较多杂酶，对于酶解的效率影响较大，一般需要进行纯化后使用。[0004]目前采用硫酸铵盐析法、离心喷雾干燥法等分离核酸酶P1的方法存在样品回收率低、分离材料或设备昂贵、样品处理量小、单一方法分离纯度低的问题；而且经硫酸铵盐析法分离方法得到的核酸酶P1含有较多杂质，效价低，且不能直接应用于食品工业中。发明内容[0005]发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种双水相萃取纯化核酸酶P1的方法。[0006]为了解决上述技术问题，本发明公开了一种双水相萃取纯化核酸酶P1的方法，用含有聚乙二醇和核苷酸二钠盐水溶液的双水相混合液从含有核酸酶P1的粗酶液中萃取纯化核酸酶P1。[0007]其中，所述的聚乙二醇分子量为1000～5000，优选为2000～3000，进一步优选为3000。[0008]其中，所述的核苷酸二钠为鸟苷酸二钠(GMPNa2)、腺苷酸二钠(AMPNa2)、肌