一种多级纯化核酸酶P1的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112760309A(43)申请公布日2021.05.07(21)申请号202110301199.1(22)申请日2021.03.22(71)申请人南京工业大学地址211816江苏省南京市浦口区浦珠南路30号申请人南京同凯兆业生物技术有限责任公司(72)发明人陈晓春张磊汤亦文李梓阳蔡家栋(74)专利代理机构江苏圣典律师事务所32237代理人仲凌霞肖明芳(51)Int.Cl.C12N9/22(2006.01)C12R1/80(2006.01)权利要求书1页说明书7页附图1页(54)发明名称一种多级纯化核酸酶P1的方法(57)摘要本发明公开了一种多级纯化核酸酶P1的方法，即将核酸酶P1粗酶液经超滤膜超滤、热灭活和树脂除杂进行多级纯化。本发明方法能够高效的分离纯化核酸酶P1，核酸酶P1的酶回收率达82.6％；而且成本低廉、可适用于大规模产业化生产。同时，本发明方法所获得的核酸酶P1纯度大大提高，比活为粗酶液的7.3倍，杂质少，所以可用于食品工业。CN112760309ACN112760309A权利要求书1/1页1.一种多级纯化核酸酶P1的方法，其特征在于，将核酸酶P1粗酶液经超滤膜超滤、热灭活和树脂除杂进行多级纯化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸酶P1粗酶液为桔青霉发酵所制得的；其中，所述的桔青霉(Penicilliumcitrinum)已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.2014。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸酶粗酶液中核酸酶P1的酶活为5000‑7000U/mL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸酶粗酶液中核酸酶P1的比活为800‑1000U/g。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超滤膜为聚醚砜膜。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超滤膜的分子量为1‑30KDa。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热灭活的温度为70‑100℃，时间为1‑60min。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述树脂为以聚苯乙烯为惰性骨架，以磺酸基作为功能基团的大孔树脂。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述树脂除杂的上样量为0.5‑2BV。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述除杂的上样速率为0.1‑0.5BV/h。2CN112760309A说明书1/7页一种多级纯化核酸酶P1的方法技术领域[0001]本发明涉及生物领域，具体涉及一种多级纯化核酸酶P1的方法。背景技术[0002]随着生物技术产业和制药工业的发展，核苷酸及其衍生物的研究和开发成为热点，并逐渐形成了继氨基酸之后的又一重大产业。核苷酸是一类具有高附加值的生化物质，用途十分广阔，支撑一些较大产业的发展，如高端乳业、医药行业等。在乳业中作为功能性添加剂，它的加入能使奶粉更接近于母乳，能够有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢疾的能力，减少腹泻的发生；在医药领域，核苷酸作为医药中间体是许多核苷酸类衍生物的生产原料，用于合成如CDP、UDP、GTP、CDP‑胆碱、SAM、cGMP、CTP、UTP、cAMP、UDP‑乙酰葡糖胺、GDP‑甘露糖、GDP‑葡萄糖、UDP‑葡萄糖类等上百种化合物。核苷酸类药物在抗癌、抗病毒、治疗心血管疾病、糖尿病及干扰诱导等方面具有独特的疗效，有着良好的应用效果和巨大的应用市场。[0003]在酶解法制备核苷酸中所需的酶是核酸酶Pl，它是一种能够水解RNA获得四种5'‑核苷酸的磷酸二酯酶，其酶解产物杂质少后续分离工艺简单，国外一般采用该方法进行核苷酸的生产。但是核酸酶P1粗酶含有较多杂酶，对于酶解的效率影响较大，一般需要进行纯化后使用。[0004]目前采用硫酸铵盐析法、离心喷雾干燥法等分离核酸酶P1的方法存在样品回收率低、分离材料或设备昂贵、样品处理量小、单一方法分离纯度低的问题；而且经硫酸铵盐析法分离方法得到的核酸酶P1含有较多杂质，效价低，且不能直接应用于食品工业中。发明内容[0005]发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种多级纯化核酸酶P1的方法。[0006]为了解决上述技术问题，本发明公开了一种多级纯化核酸酶P1的方法，将核酸酶P1粗酶液经超滤膜超滤、热灭活和树脂除杂进行多级纯化。[0007]优选地，如图1所示，将核酸酶P1粗酶液依次经超滤膜超滤、热灭活和树脂除杂进行多级纯化。[0008]具体地，包括如下步骤：[0009](1)将核酸酶P1粗酶液经超滤膜超滤，收集截留液；[0010](2)将步骤(1)所得截留液进行热灭活，固液分离，收集滤液；[0011](3)将步骤(2)所得滤液上样至树脂中除杂，收集流出液，即为多级纯化后的