联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112280723A(43)申请公布日2021.01.29(21)申请号201910665004.4(22)申请日2019.07.23(71)申请人清华大学地址100084北京市海淀区清华园北京100084-82信箱申请人广东清大智兴生物技术有限公司(72)发明人陈振刘德华秦健淞(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人黄爽(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12P7/18(2006.01)C12R1/22(2006.01)权利要求书2页说明书7页序列表22页附图3页(54)发明名称联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用(57)摘要本发明提供一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用。所述重组菌是将phaA、phaB、bld和yqhD基因通过质粒导入克雷伯氏菌(Klebsiella)中或通过基因工程手段整合到克雷伯氏菌染色体上而成。利用本发明提供的克雷伯氏菌工程菌，同时实现两种高附加值的二元醇(1,3-丙二醇和1,3-丁二醇)的生产，且两种二元醇相对于底物甘油的得率超过0.6g/g，远远大于单独生产1,3-丙二醇或1,3-丁二醇过程的收率。目标产物分离过程更加简化，从而极大提高整个生产过程的经济效益。CN112280723ACN112280723A权利要求书1/2页1.联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将phaA、phaB、bld和yqhD基因通过质粒导入克雷伯氏菌(Klebsiella)中或通过基因工程手段整合到克雷伯氏菌染色体上而成；其中，所述phaA基因来源于Cupriavidusnecator，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQIDNO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQIDNO:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质；所述phaB基因来源于Cupriavidusnecator，其为编码如下蛋白质(c)或(d)的基因：(c)由SEQIDNO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)SEQIDNO:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(c)衍生的蛋白质；所述bld基因来源于Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1或2所示；所述yqhD基因来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)，其为编码如下蛋白质(e)或(f)的基因：(e)由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f)SEQIDNO:6所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(e)衍生的蛋白质；优选地，所述克雷伯氏菌为克雷伯肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)，更优选保藏号为CGMCCNO.7824的克雷伯肺炎杆菌ACR30。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建如下：phaA、phaB基因经密码子优化后，与bld、yqhD基因一起构建到表达载体上，用重组载体转化克雷伯氏菌，筛选阳性转化子；优选地，密码子优化的phaA-phaB操纵子的序列如SEQIDNO:5所示。3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建如下：将bld-yqhD-phaAB串联基因表达盒构建到ptrc99a质粒上，用重组质粒转化克雷伯氏菌，筛选阳性转化子；其中，bld-yqhD-phaAB串联基因表达盒的序列如SEQIDNO:9和10所示。4.联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌，其特征在于，所述联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌是以权利要求2或3所述的重组菌作为出发菌株，利用基因工程手段对出发菌株进行改造，得到的细胞内NADPH供给增强的工程菌；优选地，通过增强出发菌株中与NADPH生物合成途径相关的基因，来提高细胞内NADPH的供给；更优选地，所述与NADPH生物合成途径相关的基因为pntAB基因，核苷酸序列如下：i)SEQIDNO:7所示的核苷酸序列；ii)SEQIDNO:7所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；iii)在严格条件下与SEQIDNO:7所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序2CN112280723A权利要求书2/2页列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。5.联产1,3-丙二醇和1,3-丁二