高效液相色谱串联质谱检测唾液中睾酮的方法及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113341027A(43)申请公布日2021.09.03(21)申请号202110757066.5(22)申请日2021.07.05(71)申请人艾可泰科生物科技（江苏）有限公司地址215000江苏省苏州市纳米城Ⅱ区纳米健康产业园2栋304室(72)发明人蔡俊贾鹏飞(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)G01N30/72(2006.01)G01N30/86(2006.01)权利要求书2页说明书8页附图1页(54)发明名称高效液相色谱串联质谱检测唾液中睾酮的方法及试剂盒(57)摘要本发明公开了试剂盒a.流动相：流动相A：体积比为0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈，色谱纯；b.标准品母液：睾酮的乙腈溶液；c.内标液：d3‑睾酮的乙腈溶液；d.稀释液：稀释液一：空白唾液基质溶液，3g牛血清白蛋白用水溶解定容至1L制得；稀释液二：乙腈。高效液相色谱串联质谱检测唾液中睾酮的方法：S1、采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过上述试剂盒前处理的唾液中睾酮，利用高效液相色谱将睾酮与干扰物分离；S2、利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立标准曲线。本发明检测唾液中睾酮，特异性强，灵敏度高，前处理过程较简单，精密度和加标回收率都符合要求。CN113341027ACN113341027A权利要求书1/2页1.试剂盒，包括如下试剂，其特征在于：a.流动相：流动相A：体积比为0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈，色谱纯；b.标准品母液：睾酮的乙腈溶液；c.内标液：d3‑睾酮的乙腈溶液；d.稀释液：稀释液一：空白唾液基质溶液，3g牛血清白蛋白用水溶解定容至1L制得；稀释液二：乙腈；e.萃取液：甲基叔丁基醚；f.质控品：睾酮的空白唾液基质溶液，分低QC‑L、中QC‑M、高QC‑H浓度，浓度分别为：3pg/ml、30pg/ml、80pg/ml；g.复溶溶剂：体积比为70％乙腈水溶液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，标准品母液配制方法如下：精确称取10mg睾酮标准品，用乙腈溶解定容至10ml，得到1mg/ml标准品母液。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，内标液配制方法如下：精确称取10mgd3‑睾酮标准品，用乙腈溶解定容至10ml，得到1mg/ml内标母液。4.根据权利要求1或3所述的试剂盒，其特征在于：取10μl睾酮标准品母液，用稀释2定容至10ml，得1μg/ml的睾酮标准溶液；取10μl1μg/ml的睾酮标准溶液，用稀释液二定容至10ml，得1ng/ml的睾酮标准溶液；QC‑L：取3μl1ng/ml的睾酮标准溶液，用稀释液一定容至10ml；QC‑M：取30μl1ng/ml的睾酮标准溶液，用稀释液一定容至10ml；QC‑H：取80μl1ng/ml的睾酮标准溶液，用稀释液一定容至10ml。5.高效液相色谱串联质谱检测唾液中睾酮的方法，其特征在于：S1、采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过上述试剂盒前处理的唾液中睾酮，利用高效液相色谱将睾酮与干扰物分离；S2、利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立标准曲线；S3、计算待测样本中睾酮的含量。6.根据权利要求5所述的高效液相色谱串联质谱检测唾液中睾酮的方法，其特征在于，高效液相色谱的条件为：流动相A：体积比为0.1％的甲酸水；流动相B：乙腈，纯度为色谱纯；浓度为100％；色谱柱型号：WatersXBridgeBEHC18，3.5μm,2.1mm*150mm；采用梯度洗脱方式，见表1；流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为10μl。表1流动相梯度洗脱参数2CN113341027A权利要求书2/2页7.根据权利要求5所述的高效液相色谱串联质谱检测唾液中睾酮的方法，其特征在于，质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式；喷雾电压为5500V；碰撞气为8；气帘气为20psi；离子源温度为650℃；离子源气流GS1为70psi；GS2为50psi；目标物睾酮m/z318.1→126.1，同位素内标d3‑睾酮m/z321.1→126.1；睾酮及内标的去簇电压(DP)、射入电压(EP)、碰撞电压(CE)、碰撞室射出电压(CXP)参数见表2。表2睾酮及内标的质谱参数8.根据权利要求5所述的高效液相色谱串联质谱检测唾液中睾酮的方法，其特征在于，所述经前处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500μl于2ml离心管中，加入0.25ng/ml的内标溶液20μl，加入1ml萃取液，涡旋震荡5min，13000r/min离心10min，转移有机