人血清中25羟基维生素D含量检测方法及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113655132A(43)申请公布日2021.11.16(21)申请号202110672029.4(22)申请日2021.06.17(71)申请人艾可泰科生物科技（江苏）有限公司地址215000江苏省苏州市纳米城Ⅱ区纳米健康产业园2栋304室(72)发明人蔡俊贾鹏飞(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)G01N30/86(2006.01)权利要求书3页说明书10页附图2页(54)发明名称人血清中25羟基维生素D含量检测方法及试剂盒(57)摘要本发明公开了高效液相色谱串联质谱技术检测人血清中25羟基维生素D的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：T1.洗脱液：洗脱液A：体积比为0.1％甲酸水溶液；洗脱液B：乙腈，HPLC‑MS级。人血清中25羟基维生素D含量检测方法，包括采用前处理的人血清中25羟基维生素D，S1、利用高效液相色谱将25羟基维生素D与干扰物分离；S2、利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立标准曲线；S3、计算待测样本中25羟基维生素D的含量。本发明特异性强，灵敏度高，前处理过程简单，精密度和加标回收率都基本符合要求，可以用于检测人血清中25羟基维生素D2和25羟基维生素D3的含量。CN113655132ACN113655132A权利要求书1/3页1.高效液相色谱串联质谱技术检测人血清中25羟基维生素D的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下试剂：T1.洗脱液：洗脱液A：体积比为0.1％甲酸水溶液；洗脱液B：乙腈，HPLC‑MS级；T2.标准品母液：配制：精确称取1mg25羟基维生素D3标准品和1mg25羟基维生素D2标准品，用少量甲醇溶解后用乙腈定容至10ml，得到100ug/ml25羟基维生素D标准品母液；T3.内标液：配制：精确称取1mgd3‑25羟基维生素D3标准品和1mgd3‑25羟基维生素D2标准品，用少量甲醇溶解后用乙腈定容至10ml，得到100ug/mld3‑25羟基维生素D内标母液；T4.稀释液：稀释液1：1g牛血清白蛋白用水溶解定容至100ml制得；稀释液2：乙腈；T5.萃取液：正己烷T6.质控品：25羟基维生素D的空白替代血清溶液，分低QC(L)、中QC(M)、高QC(H)浓度，浓度分别为：2ng/ml、40ng/ml、80ng/ml；取0.1ml25羟基维生素D标准品母液，用乙腈稀释定容至10ml得1μg/ml25羟基维生素D标准品溶液；QC(L)：取20μl1ug/ml的25羟基维生素D标准品母液，用稀释液1定容至10ml；QC(M)：取400μl1ug/ml的25羟基维生素D标准品母液，用稀释液1定容至10ml；QC(H)：取800μl1ug/ml的25羟基维生素D标准品母液，用稀释液1定容至10ml；T7.复溶溶剂：体积比为80％甲醇水溶液。2.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测人血清中25羟基维生素D的试剂盒，其特征在于，空白替代血清溶液采用1g牛血清白蛋白用水溶解定容至100ml制得。3.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测人血清中25羟基维生素D的试剂盒，其特征在于，所述标准品母液配制：精确称取1mg25羟基维生素D3标准品和1mg25羟基维生素D2标准品，用少量甲醇溶解后用乙腈定容至10ml得到100ug/ml25羟基维生素D标准品母液；取0.1ml25羟基维生素D标准品母液，用乙腈稀释定容至10ml得1μg/ml25羟基维生素D标准品溶液，分别取10μl，20μl，50μl，100μl，200μl，500μl，1000μl的浓度为1μg/ml25羟基维生素D标准品溶液于7个10ml容量瓶，用空白血清基质溶液定容至刻度，得浓度为1ng/ml，2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml的7个25羟基维生素D校准浓度溶液，接着分别取300μl的7个25羟基维生素D校准浓度溶液于7个2ml离心管，每管中加入1.2ml内标溶液，涡旋振荡1min后，13000r/min离心10min，取全部上清液至另一2ml离心管，50℃氮气流下吹干，残余物中加入200ul的水复溶，向其中加入1000ul正己烷涡旋萃取5min，移出有机相至另一2ml离心管室温吹干，向残余物中加入100ul80％的甲醇水，涡旋1min，进样10μl上机检测。4.人血清中25羟基维生素D含量检测方法，包括采用前处理的人血清中25羟基维生素D，其特征在于：2CN113655132A权利要求书2/3页S1、利用高效液相色谱将25羟基维生素D与干扰物分离；S2、利用同位素内标法