一种免疫细胞冻存液及其应用方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114097770A(43)申请公布日2022.03.01(21)申请号202111513176.3(22)申请日2021.12.12(71)申请人杭州中赢生物医疗科技有限公司地址310000浙江省杭州市滨江区西兴街道楚天路88号2号楼203室(72)发明人不公告发明人(74)专利代理机构南京普睿益思知识产权代理事务所(普通合伙)32475代理人何薇(51)Int.Cl.A01N1/02(2006.01)权利要求书2页说明书11页(54)发明名称一种免疫细胞冻存液及其应用方法(57)摘要本发明公开了一种免疫细胞冻存液，其组分包括：聚乙二醇3‑5mg/ml；壬基酚聚氧乙烯醚‑100.1‑0.5μg/ml；1,3‑丙二醇1.2‑3mg/ml；葡聚糖0.1‑0.5ml/ml；苜蓿素0.01‑0.05mg/ml；海藻糖0.2‑0.6mg/ml；姜黄素0.01‑0.06ml/ml；非必须氨基酸5‑8mg/ml；人血白蛋白10‑18mg/ml。本发明还公开了一种免疫细胞的冻存应用方法。本申请在冻存液中添加姜黄素，与海藻糖配合，不仅对冻存细胞具有极好的保护作用，同时细胞复苏后细胞活力极有优秀，即使对于大规模免疫细胞的冻存，细胞回收率也可保持较高水平，冻存时间可达几年甚至更长，有效保证冻存液成本。CN114097770ACN114097770A权利要求书1/2页1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，其组分包括：2.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述非必须氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。3.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，其组分包括：4.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，其组分包括：2CN114097770A权利要求书2/2页5.一种免疫细胞冻存液的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：取外周血于离心管中，20‑30℃离心30‑40min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，加到Ficoll层上使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；将外周血单核细胞与权利要求1‑4所述的免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至‑80℃，冻存5‑10h，然后转入液氮中冻存。6.根据权利要求5所述的免疫细胞冻存液的应用方法，其特征在于，所述细胞悬浮液中细胞的浓度为1‑5×107个/ml。3CN114097770A说明书1/11页一种免疫细胞冻存液及其应用方法技术领域[0001]本发明涉及免疫细胞冻存技术领域，尤其涉及一种免疫细胞冻存液及其应用方法。背景技术[0002]免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色，从血液中分离出来的单个核细胞包括：T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞等，是免疫细胞治疗中的初始细胞来源，经各类细胞因子诱导扩增培养，得到一群具有高效杀伤活性的免疫细胞群。[0003]细胞冻存技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已有深入广泛的应用，通过对供体的免疫细胞深低温保存保持其活力和功能，免疫细胞在‑70℃～‑80℃冻存，细胞活性会随着冷冻时间的延长迅速下降，在‑196℃时细胞生物学过程几乎停止，因此要长期保存免疫细胞，液氮温度是最佳的储存温度。[0004]细胞冷冻技术无论对临床还是基础研究均具有重要意义，细胞冻存经常采用渗透性保护剂，例如甘油和二甲基亚砜(DMSO)两种，而甘油作为冷冻保护剂冻存的免疫细胞存活率较低，但DMSO却可以迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，成为免疫细胞冻存最理想的冷冻保护剂。目前DMSO作为常用的细胞冷冻保存剂，不能长时间有效保存大规模培养的免疫细胞，复苏后细胞数量及活力都无法满足临床应用的标准。[0005]因而，发明人致力于寻找在未添加DMSO的前提下，能够促进冷冻保存下免疫细胞存活率，并达到能够长期保存免疫细胞效果的冻存液，具有极好的研究前景。发明内容[0006]基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种免疫细胞冻存液及其应用方法。[0007]本发明提出的一种免疫细胞冻存液，其组分包括：4CN114097770A说明书2/11页[0008][0009]优选地，所述非必须氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。[0010]海藻糖广泛存在于低等动物、藻类、细菌、真菌、酵母中，是应激代谢的重要产物，具有保护