一种近红外比率型pH荧光探针及其制备方法与其在破骨吸收成像中的应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114989253A(43)申请公布日2022.09.02(21)申请号202210681292.4(22)申请日2022.06.16(71)申请人山东大学地址250012山东省济南市历下区文化西路44号(72)发明人魏福兰蒙钇伶刘博慧崔舒悦(74)专利代理机构济南圣达知识产权代理有限公司37221专利代理师郑平(51)Int.Cl.C07K7/06(2006.01)C09K11/06(2006.01)G01N21/64(2006.01)权利要求书2页说明书10页附图9页(54)发明名称一种近红外比率型pH荧光探针及其制备方法与其在破骨吸收成像中的应用(57)摘要本发明属于口腔医学领域，提供了一种近红外比率型pH荧光探针及其制备方法与其在破骨吸收成像中的应用。本发明以半花菁分子结构为主体，以天冬氨酸六肽为骨靶向基团，通过酰胺缩合构建了一个近红外比率型pH荧光探针Hcy‑D6。Hcy‑D6具有优秀的光学特性，其利用分子内电荷转移原理可以实现对pH的比率性响应。本发明构建了体外破骨吸收模型及大鼠正畸牙移动模型，利用Hcy‑D6成功实现了体外破骨吸收活动及正畸牙移动破骨吸收活动的检测，为后续正畸牙移动骨改建体内检测方法的发展打下了基础。CN114989253ACN114989253A权利要求书1/2页1.一种用于破骨吸收成像的近红外比率型pH荧光探针，其特征在于，结构式如式Ⅰ所示：2.如权利要求1所述的用于破骨吸收成像的近红外比率型pH荧光探针的构建方法，其特征在于，包括：将N，N‑二异丙基乙胺DIPEA与2‑(7‑氮杂苯并三氮唑)‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸酯HATU溶于二甲基亚砜DMSO中，加入半花菁结构Hcy，混合均匀，加入天冬氨酸六肽Asp6进行反应，即得。3.如权利要求2所述的用于破骨吸收成像的近红外比率型pH荧光探针的构建方法，其特征在于，所述半花菁结构Hcy与天冬氨酸六肽Asp6的摩尔比为1：3～4。4.如权利要求2所述的用于破骨吸收成像的近红外比率型pH荧光探针的构建方法，其特征在于，所述DIPEA与HATU的摩尔比为1：0.6～0.9。5.如权利要求2所述的用于破骨吸收成像的近红外比率型pH荧光探针的构建方法，其特征在于，Hcy与Asp6的反应在室温、避光下搅拌过夜。6.一种体外破骨吸收检测方法，其特征在于，包括：利用密度梯度离心法纯化诱导骨髓单核细胞为破骨细胞，将其培养在无菌骨磨片上构建体外破骨吸收模型，甲苯胺蓝染色及扫描电镜检测骨吸收陷窝形成；随后将无菌骨磨片在Hcy‑D6溶液中孵育后，PBS清洗后置于24孔板内，将破骨细胞、成骨细胞分别按照前者每孔1×105，后者每孔1×104的细胞量均匀铺入含有Hcy‑D6预处理的无菌骨磨片的24孔板内，培养10～12天后，用Hoechest33342对细胞核进行荧光染色示踪，随后将骨磨片置于激光共聚焦显微镜下在633nm的激发波长下检测其在678nm和715nm处荧光信号的变化，ImageJ分析结果。7.如权利要求6所述的体外破骨吸收检测方法，其特征在于，培养过程中，每组3～4个复孔；每3～4天更换一次培养液。8.如权利要求6所述的体外破骨吸收检测方法，其特征在于，破骨细胞诱导培养液为含30ng/mLM‑SCF和50ng/mLRANKL的含10％FBS的α‑MEM细胞培养液。9.如权利要求6所述的体外破骨吸收检测方法，其特征在于，大鼠源性成骨细胞培养液为含10％FBS的α‑MEM细胞培养液。10.一种正畸加力牙移动过程中破骨吸收活动的直接检测方法，其特征在于，包括：在加力7天后对实验组及对照组进行体内成像检测，成像检测前3天，根据体重按照2CN114989253A权利要求书2/2页3.5mg/Kg剂量在左侧上颌第一磨牙近中颊侧进行局部注射权利要求1所述的Hcy‑D6；成像当天取出实验组及对照组左侧上颌骨，利用双光子激光共聚焦显微镜对左侧上颌第一磨牙近中根的近中颊侧牙槽骨进行荧光成像，成像条件：激发光为800nm，收集两个发射通道678±15nm及715±15nm的荧光信号，实验组和对照组所有成像条件设置均一致，图像处理由ImageJ完成。3CN114989253A说明书1/10页一种近红外比率型pH荧光探针及其制备方法与其在破骨吸收成像中的应用技术领域[0001]本发明属于口腔医学领域，特别涉及一种近红外比率型pH荧光探针及其制备方法与其在破骨吸收成像中的应用。背景技术[0002]公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。[0003]正畸牙移动是通过对牙齿施加一定的力量，促使牙齿周围牙周膜及牙