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为解决菌体浓度低,蛋白表达量低,不利于商业化大规模生产的技术问题,本公开提供一种重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法,包括:(1)一级种子培养;(2)二级种子培养;(3)三级种子培养;(4)发酵罐甘油培养;(5)发酵罐甘油流加补料培养;(6)甲醇诱导培养。本发明所述的重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法通过对培养基、溶氧、OD600的优化实现了过程控制简单、易于操作、重复性好的毕赤酵母吨级以上高密度发酵规模的生产。