检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的引物、探针及方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105603084A(43)申请公布日2016.05.25(21)申请号201610066149.9C12N15/11(2006.01)C12R1/32(2006.01)(22)申请日2016.02.01(71)申请人海南医学院地址571199海南省海口市龙华区城西学院路3号海南医学院申请人港大科桥有限公司(72)发明人尹飞飞陈福和吕刚袁国勇朱奇轩符瑞佳梁培陈锦龙(74)专利代理机构湖北武汉永嘉专利代理有限公司42102代理人王守仁(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)权利要求书5页说明书12页C12Q1/04(2006.01)序列表11页(54)发明名称检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的引物、探针及方法(57)摘要本发明是用液相芯片检测结核分枝杆菌耐药突变位点的引物、探针及方法，其用于检测结核分枝杆菌针对异烟肼、利福平和福诺喹酮类药物这3种药物耐药的基因突变位点。其中异烟肼耐药突变位点位于katG基因和inhA基因，利福平耐药突变位点位于rpoB基因,福诺喹酮类药物的耐药突变位点位于gyrA基因。本发明根据基因库中4种耐药相关基因的核苷酸序列分别进行同源性分析，设计引物和探针，通过两轮PCR，分子杂交，再用Luminex200系统进行检测，从而确定样本中是否含有耐药突变位点。本发明提供的耐药基因突变位点的检测，对于临床采取正确的治疗方案来治疗结核分支杆菌的感染至关重要。本发明具有检测速度快、操作简单、敏感性高、特异性好等优点，利于推广应用。CN105603084ACN105603084A权利要求书1/5页1.一种检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的引物，其特征是一种用MASA液相芯片对临床常见的3种结核分枝杆菌治疗药物的耐药相关基因突变位点进行检测的引物，该引物是根据基因库中能够检索到的目标基因所有的核苷酸序列分别进行同源性分析和设计的，具体是：(1)用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因耐药突变位点的引物F、引物R：其DNA序列是：katG-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCGGCGGTCACACTTTCGGTAkatG-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACGGGTCCGGGATGGTGCC；(2)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因耐药突变位点的引物F、引物R：其DNA序列是：inhA-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTinhA-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTTGGACACCAGCACCTCGAC；(3)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因耐药突变位点的引物F、引物R：其DNA序列是：rpoB-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCGAGCTGATCCAAAACCAGArpoB-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGACAGCGAGCCGATCAGAC；(4)用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因耐药突变位点的引物F、引物R：其DNA序列是：gyrA-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAGGAGATGCAGCGCAGCTACAgyrA-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCATTGCCTGGCGAGCCGAAGT。2.一种检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的探针，其特征是一种用MASA液相芯片检测结核分枝杆菌耐药相关基因突变位点的探针，有24种探针，它们分别与权利要求1所述的4种引物对应设计，具体是：(1)用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位氨基酸突变位点的野生型探针katG-315AGC：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGCTGGTGATCGC；(2)用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位氨基酸突变位点的突变型探针katG-315ACC：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGGTGGTGATCGC；(3)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位氨基酸突变位点的野生型探针inhA--15C：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-GACAACCTATCGTCTCGCCGCGG；(4)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位氨基酸突变位点的突变型探针inhA--15T：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-GACAACCTATCATCTCGCCGCGG；2CN105603084A权利要求书2/5页(5)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位氨基酸突变位点的野生型探针inhA--8T：其DNA序列是：NH2-(CH2)12-TCACCCCGACAACCTATCGTCTC；(6)用于检测异烟肼耐药相