小鼠/人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养液及小鼠/人的类囊胚诱导培养方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927167A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202211671175.6(22)申请日2022.12.26(71)申请人内蒙古大学地址010070内蒙古自治区呼和浩特市大学西路235号(72)发明人吴宝江包斯琴王艳秋李喜和(74)专利代理机构天津佳盟知识产权代理有限公司12002专利代理师李淑惠(51)Int.Cl.C12N5/0735(2010.01)C12N5/073(2010.01)权利要求书2页说明书4页附图2页(54)发明名称小鼠/人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养液及小鼠/人的类囊胚诱导培养方法(57)摘要一种小鼠和人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养液及小鼠和人的类囊胚诱导培养方法，利用化学成分明确的类囊胚诱导培养液，使小鼠/人的ESCs分化成自然囊胚所包含的三种不同细胞谱系，继续利用该类囊胚诱导培养液，将上一步获得的小鼠/人的含有三种不同细胞谱系的混合状态细胞，在悬浮培养的条件下诱导获得小鼠和人的类囊胚结构。本发明利用特定的类囊胚诱导培养液及诱导培养方法，使小鼠/人的ESCs自我组装产生类囊胚结构，通过实验手段验证了小鼠和人的类囊胚在形态、大小、细胞数量、细胞分布以及基因表达特征方面与自然囊胚相似，为体外组织形态发生、类器官建模和药物筛选等提供新的研究模型。CN115927167ACN115927167A权利要求书1/2页1.一种小鼠/人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养液，其特征在于：包括以下组分：每500ml类囊胚诱导培养液含CHIR99021的组成为：余量由基础培养液补充，所述基础培养液为基础培养液DMEM/F12和基础培养液Neurobasal，二者体积比为1:1。2.根据权利1所述小鼠/人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养液，其特征在于：每500ml类囊胚诱导培养液含CHIR99021的组成为：3.一种利用权利要求1或2所述小鼠/人胚胎干细胞来源的类胚胎诱导培养方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)准备含PD0325901+CHIR99021+LIF的2i/L培养液条件下培养的小鼠胚胎干细胞和2CN115927167A权利要求书2/2页TMmTeSR1培养液条件下培养的人胚胎干细胞，分别在37℃、5％CO2浓度条件下培养。(2)取步骤(1)准备的1×105个小鼠/人ESCs分别利用类囊胚诱导培养液，在37℃、5％CO2浓度条件下进行培养5‑7天，分别获得小鼠/人的含有囊胚三种类型细胞的混合细胞。5(3)取步骤(2)得到的混合细胞1×10个，在37℃、5％CO2浓度条件下利用类囊胚诱导培养液进行悬浮培养，每天更换诱导培养液，小鼠混合细胞在体外培养到3‑4天，或人的混合细胞在体外培养到6‑7天时开始形成小鼠和人的类囊胚结构。3CN115927167A说明书1/4页小鼠/人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养液及小鼠/人的类囊胚诱导培养方法技术领域[0001]本发明属于胚胎干细胞培养技术领域，特别涉及一种小鼠和人的类囊胚诱导培养液，尤其建立一种小鼠和人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养方法。背景技术[0002]胚胎干细胞(ESCs)起源于囊胚的内细胞团，可以贡献到胎儿所有组织中，但不参与胎盘发育。在合适的体外培养条件下，小鼠和人的ESCs能分化形成一种三维聚集体，称为胚状体(EBs)，它包含机体三种不同谱系细胞类型，可用来模拟早期胚胎发生研究。EBs的形成是ESCs自我组装和谱系分化的重要特征，然而EBs不能完全重塑胚胎发育的起始。[0003]在过去的几年里，基于胚胎干细胞的类胚胎研究取得了突破性进展，一些研究报道了利用小鼠或人类胚胎干细胞体外重构获得囊胚或原肠期胚胎的发育模型。但是到目前为止，小鼠类囊胚的体外诱导仍需两种或三种不同类型的干细胞共同培养才能实现，而且培养条件非常复杂。能否只利用小鼠或人的胚胎干细胞，在化学成分明确的诱导培养条件下获得类囊胚结构，未见相关报道。[0004]因此，获得一种简单高效的小鼠和人的类囊胚诱导培养液，尤其仅由小鼠和人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养方法，是解决类囊胚体外诱导方法局限性的关键。发明内容[0005]本发明所要解决的技术问题是，提供一种小鼠和人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养液，并建立类囊胚诱导培养方法，首次利用单一种类的胚胎干细胞系诱导培养获得大量的小鼠和人的类囊胚结构。[0006]为了解决上述技术问题，本发明提供一种小鼠/人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养液，其特征在于：包括以下组分：每500ml类囊胚诱导培养液含CHIR99021的组成为：4CN115927167A说明书2/4页[0007][0008]余量由基础培养液补充，[0009]所述基础培养液为基础培养液DMEM/F12和基础培养液Neu