小鼠胚胎干细胞培养液及诱导培养两种不同类型的胚胎干细胞系和类囊胚的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115975912A(43)申请公布日2023.04.18(21)申请号202211681745.X(22)申请日2022.12.26(71)申请人内蒙古大学地址010070内蒙古自治区呼和浩特市大学西路235号(72)发明人吴宝江包斯琴杨志青李喜和(74)专利代理机构天津佳盟知识产权代理有限公司12002专利代理师李淑惠(51)Int.Cl.C12N5/0735(2010.01)C12N5/073(2010.01)权利要求书3页说明书7页附图2页(54)发明名称小鼠胚胎干细胞培养液及诱导培养两种不同类型的胚胎干细胞系和类囊胚的方法(57)摘要本发明公开了一种小鼠胚胎干细胞培养液、胚胎干细胞体外诱导培养方法、以及利用该培养液和培养方法，首次从3‑4天的小鼠囊胚建立两种不同类型胚胎干细胞系，进一步利用这两种类型的干细胞系，体外诱导获得类囊胚结构。这种来源于同一个囊胚的两种细胞系聚合获得的类囊胚排除了不同个体细胞之间的免疫排斥反应，为人类干细胞的临床应用和药物筛选提供理论依据和技术支撑。该方法制备的小鼠两种不同类型的胚胎干细胞和类囊胚能用于基因编辑、动物克隆、医学模型和药物筛选研究等领域。CN115975912ACN115975912A权利要求书1/3页1.一种小鼠胚胎干细胞诱导培养液，其特征在于：包括以下组分：每500ml诱导培养液含激活素A+CHIR99021+白血病抑制因子的组成为：余量由基础培养液补充，所述基础培养液为基础培养液DMEM/F12和基础培养液Neurobasal，二者体积比为1:1。2.根据权利要求1所述小鼠胚胎干细胞诱导培养液，其特征在于：每500ml诱导培养液含激活素A+CHIR99021+白血病抑制因子的组成为：2CN115975912A权利要求书2/3页3.一种利用权利要求1所述小鼠胚胎干细胞诱导培养液从小鼠同一个囊胚建立两种不同类型胚胎干细胞系的诱导培养方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)取受精后3‑4天的小鼠囊胚，去除透明带后用小鼠胚胎干细胞诱导培养液，在37℃、5％CO2浓度状态下培养，隔天换液；(2)培养5‑7天后胚胎细胞长出200μm左右的圆形细胞克隆和圆形细胞克隆周围的扁平细胞；(3)利用玻璃针和口吸管把圆形细胞克隆挑出来，把两种形态的细胞克隆分开培养；(4)继续培养后建系，获得同一个囊胚来源的两种类型的胚胎干细胞系，即圆形形态的细胞成为ACL‑ESCs细胞系，扁平形态的细胞成为ACL‑XEN细胞系。4.根据权利要求3所述从小鼠同一个囊胚建立两种不同类型的胚胎干细胞系的诱导培养方法，其特征在于：所述小鼠的品系选自129品系小鼠、C57BL/6品系小鼠、B6D2F1杂交品系小鼠或DBA/2品系小鼠。5.一种利用权利要求3或4得到的所述ACL‑ESCs细胞系和ACL‑XEN细胞系在体外诱导建立类囊胚的应用方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)先将ACL‑ESCs细胞系和ACL‑XEN细胞系进行计数后细胞数量以1:5的比例混合、细胞总数为1×105个；(2)然后接种于抗贴壁处理的24孔板中；(3)在37℃、5％CO2浓度状态下利用小鼠类囊胚诱导培养液进行悬浮培养，隔天换液；(4)培养3‑5天后培育获得胚胎干细胞来源的类囊胚结构。6.根据权利要求5所述在体外诱导建立类囊胚的应用方法，其特征在于：每500ml类囊3CN115975912A权利要求书3/3页胚诱导培养液组成为：4CN115975912A说明书1/7页小鼠胚胎干细胞培养液及诱导培养两种不同类型的胚胎干细胞系和类囊胚的方法技术领域[0001]本发明属于细胞培养技术领域、发明的类囊胚结构涉及药理学研究领域，特别涉及一种小鼠胚胎干细胞培养液及诱导培养两种不同类型的胚胎干细胞系和类囊胚的培养方法。背景技术[0002]胚胎干细胞(Embryonicstemcell，ESCs)是由早期胚胎诱导培养获得的具有体外无限增殖、自我更新能力和多向分化的特性的细胞系。目前ESCs成为细胞治疗、体外类器官再生和高效基因编辑等领域细胞原料，具有广泛的生命科学基础研究和潜在的生物医学应用价值。哺乳动物胚胎干细胞研究开始于上世纪八十年代初，目前已成功获得小鼠、大鼠、猪、人类和牛等不同物种的胚胎干细胞系。2006年，由Takahashi和Yamanaka建立了成体细胞向诱导多能干细胞的诱导技术，获得了2012年诺贝尔生理医学奖。我国科研团队在小鼠、大鼠、人类、猪和牛等干细胞研究领域取得了多项世界领先水平的研究成果。[0003]虽然干细胞研究取得了多项突破性进展，但是胚胎干细胞多能性维持的精确调控机制仍需进一步深入研究。而且目前具有高发育潜能的ESCs多数培养在含有饲养层细胞或含有动物血清的体外培养条件下