肿瘤浸润细胞在制备抗肿瘤药物中的应用及模型构建方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115944650A(43)申请公布日2023.04.11(21)申请号202310002553.XA61P35/00(2006.01)(22)申请日2023.01.03(71)申请人青岛大学地址266071山东省青岛市市南区宁夏路308号(72)发明人张丽范天宇万亿王斌张宁刘梦阳何信佳张悦邱旭(74)专利代理机构北京奇眸智达知识产权代理有限公司11861专利代理师徐秋韵(51)Int.Cl.A61K35/17(2015.01)C12N5/10(2006.01)C12N15/867(2006.01)A61K39/395(2006.01)权利要求书2页说明书9页附图17页(54)发明名称肿瘤浸润细胞在制备抗肿瘤药物中的应用及模型构建方法(57)摘要本发明属于细胞生物学技术领域，公开了一种肿瘤浸润细胞在制备抗肿瘤药物中的应用及模型构建方法，自体瘤旁注射CCR2高表达的肿瘤浸润CD8+T细胞联合抗PD‑1在制备抗肿瘤药物中的应用；其中，所述肿瘤为小鼠肺癌及胶质瘤。本发明提供的肿瘤浸润T细胞的纯化，高达99％；CCR2高表达的肿瘤浸润CD8+T细胞对T细胞的活化作用；瘤旁注射CD8+T细胞联合皮下注射抗PD‑1；单独CD8+T细胞、抗PD‑1预处理的肿瘤浸润CD8+T细胞、转染CCR2的肿瘤浸润CD8+T细胞、抗PD‑1和转染CCR2肿瘤浸润CD8+T细胞的联合处理的治疗效果差异，免疫治疗的效果合理有效，且预期能够取得良好的疗效。CN115944650ACN115944650A权利要求书1/2页1.一种肿瘤浸润细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，自体瘤旁注射CCR2高表达的肿瘤浸润CD8+T细胞联合抗PD‑1在制备抗肿瘤药物中的应用。2.如权利要求1所述的肿瘤浸润细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为小鼠胶质瘤及肺癌。3.一种验证如权利要求1～2任意一项所述的应用效果的动物模型的构建方法，其特征在于，包括：步骤一，进行肿瘤浸润T细胞的纯化；步骤二，慢病毒转染及分析CCR2高表达的肿瘤浸润CD8+T细胞对细胞的活化作用；步骤三，确定瘤旁注射CD8+T细胞联合皮下注射抗PD‑1的间隔时间；步骤四，分析CD8+T细胞、抗PD‑1预处理的肿瘤浸润CD8+T细胞、转染CCR2的肿瘤浸润CD8+T细胞、抗PD‑1和转染CCR2肿瘤浸润CD8+T细胞的联合处理效果差异。4.如权利要求3所述的动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤一中的肿瘤浸润T细胞的纯化包括：获取小鼠肿瘤组织并用剪刀剪碎至1mm大小，手术刀片切碎，同时配置消化液；组织碎块在37℃摇床下摇动25min，消化2次；通过40μm过滤器，滤液在4℃，300g离心5min，弃上清；使用肿瘤浸润淋巴细胞分离试剂盒中的组织稀释液重悬并分离出淋巴细胞，PBS洗涤2次，重悬；使用美天旎MouseCD8+TCellIsolationKit纯化单细胞悬液的CD8+T细胞，磁珠和T细胞比例为：10μL：107；纯化的CD8+T细胞用RPMI1640培养液培养，每隔3h使用差速消化贴壁再次纯化CD8+T细胞，连续纯化2次。5.如权利要求4所述的动物模型的构建方法，其特征在于，所述消化液的配方为：RPMI1640培养基中含0.05mg/mLI型胶原酶、0.05mg/mLIV型胶原酶、0.05mg/mL透明质酸酶和0.01mg/mLDNaseI；胶质瘤为RPMI1640培养基中含0.05mg/mLⅡ型胶原酶和0.01mg/mLDNaseI。6.如权利要求4所述的动物模型的构建方法，其特征在于，所述RPMI1640培养液含10％的FBS和1％P/S。7.如权利要求3所述的动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中的慢病毒转染及分析CCR2高表达的肿瘤浸润CD8+T细胞对T细胞的作用包括：慢病毒转染CD8+T，比较空载体慢病毒转染对照组，CCR2高表达慢病毒转染组的肿瘤浸润CD8+T细胞高表达早期活化分子CD69；CD8+T细胞与肿瘤细胞共培养后，颗粒酶B、干扰素γ表达升高，确证高表达CCR2对肿瘤浸润CD8+T细胞的活化、杀伤作用。8.如权利要求3所述的动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤三中的瘤旁注射CD8+T细胞联合皮下注射抗PD‑1的间隔时间的确定包括：瘤旁注射高表达CCR2的CD8+T细胞，每天观察肿瘤大小；以肿瘤逐渐变小出现反弹为时间节点，迅速注射抗PD‑1，继续观察，直至肿瘤变小或消失。9.如权利要求3所述的动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤四中的分析CD8+T细胞、抗PD‑1预处理的肿瘤浸润CD8+T细胞、转染CCR2的肿瘤浸润CD8+T细胞、抗PD‑1和转染CCR2肿瘤浸润CD8+T细胞的联合处理效果