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(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115948344A(43)申请公布日2023.04.11(21)申请号202310091725.5A61P13/12(2006.01)(22)申请日2023.02.10(71)申请人上海交通大学地址200030上海市徐汇区华山路1954号(72)发明人霍云龙首健(74)专利代理机构苏州创元专利商标事务所有限公司32103专利代理师范晴(51)Int.Cl.C12N5/10(2006.01)C12N5/0783(2010.01)A61K35/17(2015.01)A61P39/06(2006.01)A61P11/00(2006.01)A61P1/16(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图3页(54)发明名称嵌合抗原受体NK细胞、制备方法及其用途(57)摘要本发明涉及新型嵌合抗原受体NK细胞、制备方法及其用途,其中包括对CAR结构的设计和调控CAR‑NK细胞的基因表达,从而增强CAR‑NK细胞的存活时间、增殖和杀伤能力;同时加入自杀基因,增强CAR‑NK细胞的可控性;其还包括靶向FAP、CD248的CAR‑NK细胞的制备和对心力衰竭等纤维化疾病的治疗;以及靶向uPAR的CAR‑NK细胞的制备和对衰老的治疗。CN115948344ACN115948344A权利要求书1/2页1.嵌合抗原受体NK细胞,其特征在于,包括向NK细胞导入用于编码CAR的核酸和调控CAR‑NK细胞基因表达的核酸;所述调控CAR‑NK细胞基因表达包括上调内源基因表达、下调内源基因表达和加入自杀基因;所述CAR的结构包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内结构域,所述抗原结合结构域特异性识别并结合靶细胞上的抗原,激活胞内结构域。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体NK细胞,其特征在于,所述抗原结合结构域包括:scFv。3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体NK细胞,其特征在于,所述铰链结构域用于连接单链抗体和跨膜结构域,其包括CD8和CD28。4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体NK细胞,其特征在于,所述跨膜结构域用于穿过细胞膜,将所述CAR锚定在细胞膜上,其包括CD8、CD28、NKG2D、proMP。5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体NK细胞,其特征在于,所述胞内结构域用于传递并放大单链抗体的激活信号,从而激活NK细胞并杀伤靶细胞,其包括共刺激域和信号传导域。6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体NK细胞,其特征在于,所述共刺激域包括:CD28、4‑1BB、2B4。7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体NK细胞,其特征在于,所述信号传导域包括CD3zeta。8.权利要求1~7任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:提取NK细胞;将编码CAR的核酸导入NK细胞获得CAR‑NK细胞;对所述CAR‑NK细胞基因表达进行调控。9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法,其特征在于,提取NK细胞包括:获取原代NK细胞或NK细胞系。10.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法,其特征在于,所述获取原代NK细胞包括:从外周血或脐带血中提取淋巴细胞,使用CD56磁珠分选出NK细胞,使用含白细胞介素2(IL2)的培养基扩增NK细胞;或者,所述获取NK细胞系包括:使用NK‑92、NK‑92MI等细胞系,使用相应培养基扩增。11.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法,其特征在于,所述编码CAR的核酸的导入包括:使用含CAR核酸序列的慢病毒或逆转录病毒转染所述NK细胞,以得到CAR‑NK细胞。12.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法,其特征在于,对所述CAR‑NK细胞的基因表达进行调控包括:上调内源基因表达、加入自杀基因和下调内源基因表达。13.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法,其特征在于,所述上调内源基因表达和加入自杀基因步骤包括:在CAR核酸序列之后插入第一目的基因序列和自杀基因序列得到目标基因序列,再使用包含所述目标基因序列的慢病毒或逆转录病毒转染所述CAR‑NK细胞。14.根据权利要求13所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法,其特征在于,所述下调内源基因表达包括:使用CRISPR/Cas9技术敲除第二目的基因序列。15.根据权利要求14所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法,其特征在于,所述第一目2CN115948344A权利要求书2/2页的基因包括:IL15、IL7、CCR2、Bcl‑2、MCL1、CD16;所述自杀基因包括:HSV‑TK、iCasp‑9、利妥昔单抗结合表位。16.根据权利要求15所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法,其特征在于,所述第二目的基因包括:EBAG9、RASA2。17.