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(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115947869A(43)申请公布日2023.04.11(21)申请号202211513174.9A61K35/17(2015.01)(22)申请日2022.11.28A61K38/20(2006.01)A61K38/17(2006.01)(71)申请人广州佰芮慷生物科技有限公司A61P31/22(2006.01)地址510663广东省广州市黄埔区科学城科研路3号自编A5栋403房(72)发明人麦秋穗何柏林邓世楷王聪张玲黎诚耀(74)专利代理机构深圳中圳知识产权代理事务所(普通合伙)44768专利代理师廖苑滨李健威(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C12N15/62(2006.01)C12N15/867(2006.01)C12N5/10(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表(电子公布)附图8页(54)发明名称一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR-NK细胞及用途(57)摘要本发明公开了一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR‑NK细胞及用途。一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体,其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL‑15/IL‑15Rα细胞因子。本发明涉及的CAR结构一方面可以结合HCMV感染细胞,杀伤病毒感染细胞,同时也能发挥诱饵作用,竞争性结合病毒颗粒,抑制其感染作用。本发明方法进行CAR基因转导,CAR在NK细胞中表达阳性率最高可达90%以上,分群明显,随着时间推移CAR表达比例稳定。CN115947869ACN115947869A权利要求书1/1页1.一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体,其特征在于,其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL‑15/IL‑15Rα细胞因子。2.根据权利要求1所述的靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体,其特征在于,还包含位于所述胞外抗原结合域和所述跨膜区之间的铰链域。3.一种核苷酸,其特征在于,其编码如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体。4.一种表达载体,其特征在于,其包括权利要求3所述的核苷酸。5.根据权利要求4所述的表达载体,其特征在于,所述载体是病毒载体。6.根据权利要求5所述的表达载体,其特征在于,所述病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。7.一种靶向人巨细胞病毒的CAR‑NK细胞,其特征在于,其用权利要求4‑6任一项所述的载体转导。8.一种靶向人巨细胞病毒的CAR‑NK细胞的构建方法,其特征在于,其包括以下步骤:(1)构建靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体,其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL‑15/IL‑15Rα细胞因子;(2)嵌合抗原受体转导NK细胞,步骤如下:①构建包含嵌合抗原受体的逆转录病毒载体:将步骤(1)的嵌合抗原受体通过NcoI和MluI酶切位点克隆到SFG.CNb30_opt.IRES.eGFP载体内;挑选单克隆进行酶切鉴定、测序鉴定,鉴定正确的质粒再转化感受态DH5α,扩增后提取质粒;质粒转染293A细胞,进行CAR蛋白表达鉴定;②逆转录病毒包装;③NK细胞分选和激活;用磁珠法分选得到NK细胞,与100Gy辐照后的CD48/4‑1BBL/mbIL‑21K562细胞按照固定比例共培养激活,激活后第四天进行病毒感染;④病毒感染:感染前以PBS配制相应体积的RetroNectin溶液包被Non‑treatedTissueCulture24孔板,500mL/孔,封口膜封口4℃包被过夜或37℃包被2小时,RetroNectin溶液回收后在‑20℃冻存,可冻融2次;包被后弃去RetroNectin,加入病毒液,Parafilm封闭孔板,离心2000g×9分钟,RT,收取激活后的NK细胞,以一定密度中烟,接种后再离心Parafilm封闭孔板,离心2000g×9分钟,RT。9.一种组合物,其包括如权利要求7的CAR‑NK细胞或由权利要求8构建方法构建的CAR‑NK细胞,和药学上可接受的载体。10.如权利要求7所述的细胞在制备治疗靶向人巨细胞病毒感染的药物中的用途。2CN115947869A说明书1/7页一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR‑NK细胞及用途技术领域[0001]本发明涉及生物技术工程领域,具体涉及了一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR‑NK细胞及用途。背景技术[0002]人巨细胞病毒(HCMV)感染是造血干细胞移植(HSCT)或实体器官移植(SOT)术后的常见并发症,被称为移植的巨魔。移植术后HCMV感染可直接引发肺炎、肝炎、胃肠疾病、脑炎和CMV综合征等,还会间接增加急慢性排斥反应和其他机会感染的发生率,严重影响预后。移