虫草麦角甾醇及其合成途经相关基因分析.doc

虫草麦角甾醇及其合成途经相关基因分析麦角甾醇是虫草类真菌主要的甾醇类成分,具有抗肿瘤、抗炎、抗纤维化等药理活性,在医药领域表现出巨大的潜在应用价值。然而关于虫草麦角甾醇的研究缺乏系统的探索和评价,虫草麦角甾醇基础研究及产业开发均较为薄弱。本研究对虫草麦角甾醇提取方法、不同虫草物种及菌株间含量分布特征以及其合成途径相关基因等进行探索,主要获得以下结果:1利用响应面分析法对HPLC测定虫草麦角甾醇方法进行优化。以提取溶剂甲醇浓度、固液比、浸泡时间、超声时间、超声次数为初步考察因素进行单因素试验,在此基础上应用响应面法,考察固液比、浸泡时间及超声时间对虫草麦角甾醇提取量的影响,优化提取工艺。试验获得较优提取工艺条件为:提取溶剂纯甲醇,固液比1:40,浸泡时间3.3h,超声时间50min,超声提取次数两次。验证试验证明模型预测值与实验值之间具有良好的拟合性,结合方法性验证,证明提取及测定方法稳定可行。2测定不同科属8种虫草菌丝体生长过程中生物量及麦角甾醇含量,并结合总麦角甾醇含量,绘制时间曲线,揭示三者随时间变化规律,并分析虫草菌丝体麦角甾醇含量与生物量的相关性。结果显示,菌丝体生长过程中,生物量多为先升高再持平最后降低规律,而虫草麦角甾醇含量则多呈持续上升趋势。整个生长过程中两者变化不一致,且相关性分析显示两者无相关,但在生物量最大值前期两者均有不同程度正相关,表明以麦角甾醇含量指示生物量并不适用于虫草全生长期。在100天生长期内,麦角甾醇含量并没有可确定的最大值期。3选择7种不同科属虫草,每种10个菌株,测定此70个菌株菌丝体生物量最大值时麦角甾醇含量,分析虫草麦角甾醇在虫草菌株间和物种间含量分布特征,并结合生物量筛选虫草麦角甾醇高产菌株。结果表明,不同菌株生物量及麦角甾醇含量有很大差异,特别是麦角甾醇含量变幅达0.34mg/g-12.22mg/g,物种间则差异不显著。巢式方差分析显示麦角甾醇含量及总麦角甾醇含量变异主要来源于菌株间(变异方差百分比92.55%和94.28%),生物量变异则多来源于物种间(变异方差百分比59.06%)。同时发现同一菌株生物量与麦角甾醇含量分布不一致,结合两者筛选出的总麦角甾醇高产菌株为OLP104XS10(9.98mg/100mL),可作为虫草麦角甾醇开发用优良菌株。4用模式真菌酿酒酵母麦角甾醇合成全通路中明确的23个基因及其编码序列,在GenBank数据库中开展同源相似性搜索,对虫草麦角甾醇代谢通路基因进行分析。对虫草菌株4个关键基因(ERG4、ERG6、ERG7、ERG9)扩增测序,解析4基因序列变异及进化特征。对已开展基因组测序的15个虫草物种16个菌株,完成了麦角甾醇代谢通路22个基因完整注释,建立虫草麦角甾醇代谢通路基因数据库。构建虫草麦角甾醇全通路基因树,发现其拓扑结构与物种系统发育关系一致,显示其可作为系统发育分析良好分子标记。通过基因扩增,获得7个物种19个麦角甾醇含量差异菌株的ERG4、ERG6、ERG7、ERG9四个基因序列。单基因聚类树及变异位点分析发现不同物种间序列变异较大,同一物种不同菌株间除蝉棒束孢大多无变异外,其他物种内均有不同程度变异,但单核苷酸及氨基酸变异与含量差异间未发现相关性。本论文的研究结果提供了一种快捷有效的虫草麦角甾醇含量检测及质量控制方法。探明了虫草菌丝体生长过程中麦角甾醇含量变化规律,且其指示虫草生物量具有一定时间局限性。明确不同虫草不同菌株麦角甾醇含量分布特征,并筛选出高产麦角甾醇菌株,为下一步研究开发提供了优良菌株资源。建立了虫草麦角甾醇代谢通路基因数据库,并解析部分基因变异特征,为寻找和确定通路中药物靶点以及基因工程育种提供参考依据。