大豆β-伴大豆球蛋白α亚基基因转化大豆初步研究.doc

大豆β-伴大豆球蛋白α亚基基因转化大豆初步研究RNA干涉(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引起的特异性序列的转录后基因沉默。大豆种子的储藏蛋白基因的表达调控主要发生在转录水平和转录后水平上。提高11S球蛋白的含量或降低7S球蛋白的含量可改善大豆蛋白的功能特征和营养品质,却不会改变总蛋白质和脂肪的含量。因此,本实验以p-伴大豆球蛋白α亚基基因为靶基因设计RNA干扰载体,并将其转化大豆,探究此基因对提高种子中含硫氨基酸的贡献,推测大豆11S与7S的调控机制。本实验对该基因进行了以下几个方面的研究：首先,根据大豆β-伴大豆球蛋白α亚基基因序列(GenBankNo.AB051865)同大豆基因组数据库的比对结果,初步认定,该基因在大豆基因组中具有两个拷贝,这两个拷贝都位于第20号染色体上,分别对应Glyma20g28650和Glyma20g28660.这两个拷贝在编码区上都包含6个外显子与5个内含子,ORF完全相同,且都编码605个氨基酸。用7Sα因编码的氨基酸序列与同源基因绘制的进化树表明,与苜蓿(Mt)的亲源关系最近,与毛果杨(Pt)的亲源关系最远。在7Sα基因表达形成的蛋白质的N端检测到跨膜结构和信号肽。根据Gm7Sa基因的特点,借助Gateway方法,构建了该基因的干扰载体(简写为pBI-Gm7SaRi)。在对农杆菌介导的大豆子叶节的遗传转化体系中灭菌时间,标记基因的筛选压进行优化后,用构建好的干扰载体对组培性状良好的大豆品种进行了转化。最终获得了71株转化苗,T0代收获种子161粒,播种于大田后,由于鸟害等的影响,成活65株。除对转化苗的表型进行观察外,还做了进一步的实验研究,即对T1代进行除草剂涂抹实验,叶片的PCR检测以及荧光定量确定拷贝数等多种方法对转化苗进行检测后,确定了20株阳性转基因植株,其中南农88-1有13株,Jack有7株。高代RNAi-Gm7Sa转基因植株采用系谱法对后代进行选择。选择优良单株,收获种子后点播成行。分别对转基因后代进行分子检测和氨基酸含量测定,发现Gm7Sa表达受到抑制的后代植株中,其种子中含硫氨基酸含量也会提高。