丙泊酚保护肾脏缺血再灌注损伤的分子机制研究.doc

丙泊酚保护肾脏缺血再灌注损伤的分子机制研究背景：肾脏的缺血再灌注损伤可导致急性肾功能衰竭,该病理生理过程常见于心血管手术,脏器移植手术,低血容量休克,脓毒性休克等ICU行机械通气患者也可单独发生或合并其他脏器衰竭,严重威胁患者生命。在麻醉或镇静过程中选择合适的药物对肾脏缺血再灌注损伤进行加以保护尤为重要。丙泊酚是麻醉及ICU常用的镇静药物,已有报道认为可以减轻多种脏器(包括脑,心脏,肝脏等)的缺血再灌注损伤,丙泊酚对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及相关机制还少有研究,我们进行了细胞及大鼠在体的研究以阐述相关保护作用及分子机制。第一部分：力‘法：使用AntimycinA耗竭ATP处理人肾小管上皮细胞(HKC)后更换正常基质复制肾脏缺血再灌注损伤的细胞模型。研究分为：1)对照组：2)细胞与内泊酚(20umol/L)共培养组；3)缺血再灌注损伤组；4)细胞与丙泊酚(20umol/L)共培养后给予缺血再灌注损伤组。Hoechst-33258染色检测HKC细胞凋亡,MTT比色法测定各组细胞活力,荧光流式细胞术检测细胞内ROS含量,化学发光法测定各组细胞总SOD活性,TBA比色法检测细胞内丙二醛,Westernblot检测HKC细胞caspase-3的表达,ElectrophoreticMobilityShiftAssay(EMSA)检测NF-KB的表达,激光共聚焦检测HIF1-α的表达,Western-blot检测HIF1-α表达量。结果：ATP耗竭处理后能引起SOD活性减低,淸除氧自由基减少,导致细胞活性氧(ROS)产生增加,直接产物MDA水平升高,同时Caspase-3活性明显增强,细胞凋亡增加,细胞存活数量减少。反映炎症反应的NF-κB激活,丙泊酚预处理能够使缺血/再灌注情况下的HKC细胞内SOD活性的减低有所减轻,进面能够清除更多的氧自由基,使MDA和ROS产生减少,相比损伤组,丙泊酚预处理caspas-3活性及NF-κB激活有部分抑制,使HKC细胞凋亡减少。单独将细胞与丙泊酚共培养组HIF1-α表达与空白对照组相比无差异,均处于低水平。结论：丙泊酚预处理对肾近曲小管细胞缺血再灌注损伤有保护作用,其分子机制包括减轻氧自由基基损害,减少细胞凋亡,抑制炎症反应,但并没有诱导细胞自我保护机制HIF-1α表达。第二部分方法：Wistar大鼠随机分为5组：(Ⅰ)对照组；(ⅱ)假手术对照组；(ⅲ)丙泊酚(25mg/kg/h)对照组；(ⅳ)缺血再灌注组；(ⅴ)丙泊酚预处理后缺血再灌注组。双侧肾动脉夹闭60分钟,再灌注24小时候分别取血及肾脏组织进行损伤的评估及分子生物学分析。光镜观察肾脏病理改变,肾小管病理改变评分采用半定量方法,检测大鼠肾功能(肌酐、胱抑素C),检测肾组织SOD及MDA水平评价氧自由基损害程度。使用Westernbloting及northen-blotting分析caspas-3活性,EMSA检测NF-κB的表达,Westernbloting定量肾组织HIF-1α。结果：模型中缺血再灌注使肾组织肾小管上皮细胞刷状缘脱落,肾小管管腔扩张,蛋白管型明显增加,间质炎细胞浸润,组织学评分较对照组显著增高,肾功能指标血清肌酐和胱抑素C显著增加,同时肾组织SOD及MDA水平,caspas-3,NF-KB活性明显增加。丙泊酚预处理显著减轻了组织学损伤及血清肾功能指标,与此同时肾组织SOD降低及MDA升高水平均较损伤组减轻。丙泊酚预处理部分抑制了缺血再灌注损伤导致的Caspase-3及NF-KB激活。丙泊酚输注组HIF-1α与对照组及假手术组均处于较低水平。结论：丙泊酚(25mg/kg/h)预先输注对大鼠肾缺血再灌注损伤模型有保护作用,其分子机制包括减轻氧自由基基损害,抑制细胞凋亡,减轻炎症反应,但并没有诱导细胞自我保护机制HIF-1α表达。