丙泊酚与七氟烷对缺血再灌注损伤的保护作用的机制研究.doc

丙泊酚与七氟烷对缺血再灌注损伤的保护作用的机制研究研究背景和意义缺血再灌注损伤是临床实践中比较多见的病理生理过程,如果处置不合理,容易对患者多个脏器造成损伤,影响预后,严重者甚至会危及其生命。血管是组织细胞与血液进行营养交换的重要场所,血管损伤也是缺血再灌注损伤中的基本病理改变,内皮细胞是血管和组织之间的重要屏障。事实上,在器官的缺血再灌注损伤中,血管损伤通常最先发生,血管内皮细胞的凋亡也先于组织细胞。血管内皮细胞的损伤,导致血管内炎性细胞以及炎性分子直接进入组织,加重组织细胞的损伤。研究血管内皮细胞的缺血再灌注损伤分子机制,具有非常重要的临床价值。肝脏的损伤可以由多种病理途径引起,如肝脏缺血再灌注和肝脏硬化。肝脏缺血再灌注损伤的发生主要有以下两个部分：一是由于肝脏本身在缺血过程中发生的损伤,二是当已经存在缺血的肝脏发生血液再灌注时产生的损伤。已有研究证实,肝脏缺血再灌注涉及多种不同过程,包括缺血时的三磷酸腺苷(ATP)耗竭、乳酸堆积和酸中毒,活性氧、脂质和氮类等自由基的生成,钙离子超载以及中性粒细胞活化。当肝细胞发生缺血及缺氧时,线粒体内有氧呼吸受到抑制,发生无氧呼吸,肝细胞内ATP大量减少、迅速耗竭,依赖ATP的各种细胞活动停止；代谢终产物不能够迅速排出体外,细胞内乳酸堆积,造成pH值降低和代谢性酸中毒,从而引起肝细胞损伤。丙泊酚(propofol)是临床常见的一类静脉麻醉用药,近年来研究证实,丙泊酚在术中参与了多种脏器的保护,如脑、肺脏、脊髓、心血管、肾脏等。目前,尽管丙泊酚保护脏器的分子机制已有研究,但是其确切的保护机制依然不明确,参与这一过程的新的基因和蛋白还有待发现,这对于缺血再灌注损伤保护类药物的开发和临床应用具有重要的价值。miRNA-17分子是miR-17-92家族成员之一,最初被发现在肿瘤中表达异常升高而受到关注,目前研究证实,miRNA-17是重要的一个癌基因,与多种肿瘤的发生发展关系密切。另一外面,miRNA-17与心脏、肺脏、脑等多种组织细胞的发育关系密切。研究发现,缺氧能够引起血管内皮细胞中miRNA-17的表达改变,提示miRNA-17可能在缺血再灌注中发挥生物学功能。STATs是一种可以和目标基因调控区DNA结合的蛋白家族,STATs在人和哺乳动物中已经有7个成员被发现,分别是：STAT1、STAT2、STAT3、STA4、STAT5a、STAT5b、STAT6。很多细胞外信号可以激活JAK-STAT通路,调节目标基因的表达,进而起到多种作用。STAT3信号通路与细胞凋亡有关,抑制STAT3活性可诱导凋亡。丙泊酚广泛用于临床麻醉,研究报道其对心脏、脑和下肢的缺血再灌注损伤具有保护作用。类似地,丙泊酚也广泛用于肝移植,因为肝衰竭不会对其代谢产生显著影响。已有学者证明,吸入性麻醉药在肝脏缺血之后可保留肝脏血流和细胞功能。七氟烷是20世纪90年代广泛开始应用的一种卤素麻醉剂,目前已成为常用的全身麻醉用药。与其他吸入麻醉剂类似,七氟烷可通过降低Ca2+浓度并干扰钙稳态而直接舒张支气管平滑肌,从而发挥支气管扩张剂的作用。因此,本项目拟研究miRNA-17在丙泊酚调控血管内皮细胞保护作用中的分子机制；同时构建肝脏缺血再灌注大鼠模型,探讨丙泊酚和七氟烷是否对肝脏缺血再灌注具有保护作用及其具体的作用机制。第一部分丙泊酚通过调控miR-17激活STAT3信号通路抑制人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤目的研究miRNA-17在丙泊酚诱导的血管内皮细胞保护作用中的分子机制。方法1.体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),构建缺氧复氧的细胞模型；根据处理因素的不同,分为H/R组,H/R+propofol150μmol/L组,H/R+miR-17inhibitor组,H/R+miR-17scramble组(NC)；2.利用Real-timePCR技术检测丙泊酚对血管内皮细胞中miR-17表达水平的影响；3.利用CCK-8实验检测丙泊酚对HUVECs保护作用；4.利用Annexin-V/PI双染法及流式细胞术证实miR-17抑制剂对凋亡的抑制作用；5.利用Westernblot检测丙泊酚处理和miR-17表达后Bax和Bcl-2的变化；6.利用Westernblot检测miR-17对STAT3表达的影响,利用Westernblot分析miR-17模拟物转染后STAT3蛋白的变化；7.通过双荧光素酶报告实验鉴定miR-17与STAT3mRNA的结合。结果1.Real-timePCR分析发现,HUVECs和H/RHUVECs中的miR-17表达无明显改变。但是,经丙泊酚处理后,正常细胞和H/R细胞中的miR-17表达均显著下降。这些结果表明,miR-17对H/R导致的血管内皮细胞损伤可能具有保护作用；2.CCK-8试验表明,H/R