一种靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115969810A(43)申请公布日2023.04.18(21)申请号202211522020.6A61K47/59(2017.01)(22)申请日2022.11.30A61K47/46(2006.01)A61K47/42(2017.01)(71)申请人郑州大学A61K31/7105(2006.01)地址450001河南省郑州市高新技术开发A61P35/00(2006.01)区科学大道100号A61P25/00(2006.01)(72)发明人史进进尹娜刘军杰李娇C12R1/19(2006.01)郭明明王文亚裴斐(74)专利代理机构郑州天阳专利事务所(普通合伙)41113专利代理师蔡文雅(51)Int.Cl.A61K9/51(2006.01)C07K19/00(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N1/06(2006.01)权利要求书2页说明书8页序列表（电子公布）附图10页(54)发明名称一种靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法及其应用(57)摘要本发明涉及靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法及其应用，可有效解决现有技术难以跨越血脑屏障的问题，其解决的技术方案是，构建pET‑30a(+)‑inaX‑N‑angiopep‑2重组质粒表达载体，转化至E.coilBL21(DE3)感受态细胞中，得重组菌株，将重组菌株涂布于LB固体琼脂培养基上，培养过夜，挑取单菌落至LB肉汤培养基中，用异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导，通过验证Angiopep‑2多肽的表达之后，用溶菌酶消化菌体沉淀，经过超滤离心，制备得到Angiopep‑2菌膜；将PEI和CpG孵育，加入Tris‑HCl和盐酸多巴胺粉末，得到PDA‑PEI‑CpG；然后将Angiopep‑2菌膜和PDA‑PEI‑CpG孵育，即得，本发明制备得到的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒，解决了药物治疗中脑胶质瘤血脑屏障难以穿透等问题，操作简单方便，有广泛的应用前景。CN115969810ACN115969810A权利要求书1/2页1.一种靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）重组菌株的制备：在NCBI上获取inaX‑N基因序列，将inaX‑N和angiopep‑2基因序列插入pET‑30a(+)载体NdeⅠ和XhoⅠ之间，构建pET‑30a(+)‑inaX‑N‑angiopep‑2重组质粒表达载体，转化至E.coilBL21(DE3)感受态细胞中，得重组菌株；2）angiopep‑2菌膜的制备：将步骤1）得到的重组菌株涂布于含硫酸卡那霉素的LB固体琼脂培养基上，37℃培养过夜，挑取单菌落至含硫酸卡那霉素的LB肉汤培养基中，在37℃恒温摇床中振荡培养2h‑4h，保持37℃，用异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导6h‑8h，得到inaX‑N‑angiopep‑2培养物，收集菌液，取菌液离心，PBS洗涤，加入配好的溶菌酶，置于37℃水浴锅中孵育20‑40min，取出菌液加入PBS分散在100KD的超滤管中，离心，PBS洗涤，除去未破膜的大肠杆菌和细菌内容物，将得到大肠杆菌生物膜重悬于PBS中，得angiopep‑2菌膜；3）PDA‑PEI‑CpG的制备：将PEI(10KD)和CpG在25℃水浴条件下孵育，超滤离心去除水，加入Tris‑HCl和盐酸多巴胺粉末，室温搅拌，即得PDA‑PEI‑CpG；4）靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备：提取步骤2）制备的angiopep‑2菌膜，不裂解，做BCA蛋白定量，将angiopep‑2菌膜和步骤3）得到的PDA‑PEI‑CpG按照质量比6：1~16：1对其包膜，先超声5‑10min，再用超滤管离心，洗涤，即得靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒angiopep‑2菌膜@PDA‑PEI‑CpG。2.根据权利要求1所述的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤2）中的大肠杆菌为BL21(DE3)大肠杆菌，溶菌酶的浓度为1mg/ml，超滤管截留分子量为100KD。3.根据权利要求1所述的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤3）中，PEI(10KD)浓度为2mg/ml，CpG为B型CpG，序列为TCCATGACGTTCCTGACGTT，浓度为0.5mg/ml，N/P比值为6，Tris‑HCl为10Mm，PH为8.5。4.根据权利要求1所述的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤4）中，超滤管截留分子量为100KD。5.根据权利要求1所述的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的靶向中性粒细胞的菌膜载药纳米粒的粒径为190‑250nm。6.根据权利要求