一种比率型荧光探针及其制法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115974837A(43)申请公布日2023.04.18(21)申请号202211652481.5(22)申请日2022.12.21(71)申请人中国消防救援学院地址102202北京市昌平区南口镇南雁路4号(72)发明人倪梅聂海亮王朝俊(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002专利代理师刘璞(51)Int.Cl.C07D401/06(2006.01)C09K11/06(2006.01)G01N21/64(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图3页(54)发明名称一种比率型荧光探针及其制法和应用(57)摘要本发明属于酶活性检测技术领域，具体涉及一种比率型荧光探针及其制法和应用。该比率型荧光探针具有式(1)所示结构，特别适用于检测丁酰胆碱酯酶的活性以及监测有机磷农药和氨基甲酸酯农药对丁酰胆碱酯酶的抑制作用，具有精准度高、灵敏度高、选择性强、响应快、稳定性好、操作简单的优点，尤其是利用其双发射峰的荧光强度比值对丁酰胆碱酯酶活性进行分析，通过自校正方式能够有效降低探针浓度、微环境、光源强度等因素的干扰。CN115974837ACN115974837A权利要求书1/1页1.一种比率型荧光探针，其特征在于，具有式(1)所示结构：2.权利要求1所述比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在碱的条件下，式(2)化合物与环丙基甲酰氯在有机溶剂中反应，得到式(1)化合物；3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，相对于1毫摩尔的式(2)化合物，所述环丙基甲酰氯的用量为1～6毫摩尔，所述碱的用量为2～12毫摩尔，所述有机溶剂的用量为20～60毫升。4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述碱选自碳酸铯、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、吡啶、哌嗪、三乙胺、N,N‑二甲氨基吡啶中的至少一种；所述有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、四氢呋喃、乙腈、丙酮、N,N‑二甲基甲酰胺和1,2‑二氯乙烷中的至少一种。5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为‑20℃～40℃；反应时间为2～12小时。6.权利要求1所述的比率型荧光探针或权利要求2‑5任一项制备方法制备得到的比率型荧光探针在检测丁酰胆碱酯酶活性中的应用。7.权利要求1所述的比率型荧光探针或权利要求2‑5任一项制备方法制备得到的比率型荧光探针在监测有机磷农药和氨基甲酸酯农药对丁酰胆碱酯酶的抑制作用中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述有机磷农药选自对氧磷、甲拌磷、敌百虫、甲胺磷、敌敌畏、马拉硫磷、毒死蜱、乐果、对硫磷中的一种或任意几种的组合；所述氨基甲酸酯农药选自西维因、涕灭威、克百威、灭多威中的一种或任意几种的组合。9.一种丁酰胆碱酯酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的比率型荧光探针或权利要求2‑5任一项制备方法制备得到的比率型荧光探针加入到待测样品中，在一定温度下进行孵育，测定生成的荧光物质的荧光光谱，可观察到两个发射峰，通过测量并计算两个发射峰的强度比，利用该比值与丁酰胆碱酯酶浓度的对应关系能够定量丁酰胆碱酯酶的活性。10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述孵育的温度为20‑45℃，pH值为4‑8，时间为20‑60min；所述测定生成的荧光物质的荧光光谱具体为：对所述生成的荧光物质使用370‑450nm范围内光进行激发，存在荧光发射，该发射波长范围为400‑800nm，可观察到两个发射峰。2CN115974837A说明书1/5页一种比率型荧光探针及其制法和应用技术领域[0001]本发明属于酶活性检测技术领域，具体涉及一种比率型荧光探针及其制法和应用。背景技术[0002]丁酰胆碱酯酶(BChE)是一种丝氨酸水解酶，由肝脏产生，广泛存在于血液、肝脏及神经胶质中。血清中BChE活性的降低常见于肝炎、肝癌等发病过程，而其活性的升高见于阿尔兹海默症、糖尿病、高血压等发病前期。由于有机磷类和氨基甲酸酯类农药能够抑制BChE的活性，血液中BChE活性浓度也是诊断两类农药中毒的重要指标。因此，发展BChE活性的检测方法对相关疾病和农药中毒的早期诊断具有重要意义。[0003]荧光探针具有灵敏度高、特异性强、操作简单、响应快速、成本低等特点，逐渐成为测定BChE的新型工具。目前，已报道的绝大多数BChE荧光探针通过测定酶解产物硫代胆碱的浓度来间接定量酶活性，存在受硫醇干扰严重、灵敏度低、操作繁琐等缺点。现有的数个可直接检测BChE活性的荧光探针大部分都是增强型荧光探针，仅能依据荧光强度定量酶活性，检测结果容易受到探针浓度分布、光稳定性、微环境(pH值，极性，温度等)、仪器稳定性等多种不确性因素的影响，准确性较低。相比而言，比率型荧