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(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115992116A(43)申请公布日2023.04.21(21)申请号202210886241.5C12N5/071(2010.01)(22)申请日2022.07.26A61K38/47(2006.01)A61P31/04(2006.01)(71)申请人扬州大学A61P37/08(2006.01)地址225009江苏省扬州市大学南路88号A61P15/14(2006.01)(72)发明人杨章平张志鹏杨奕陈代杰A61P29/00(2006.01)陈志徐天乐A23C9/12(2006.01)(74)专利代理机构南京纵横知识产权代理有限A23K20/189(2016.01)公司32224A23K50/40(2016.01)专利代理师董建林A23L3/3571(2006.01)(51)Int.Cl.C12N9/36(2006.01)C12N15/113(2010.01)C12N15/12(2006.01)C12N15/65(2006.01)C12N5/10(2006.01)权利要求书1页说明书11页序列表(电子公布)附图10页(54)发明名称一种多功能奶牛溶菌酶及其制备方法和应用(57)摘要本发明属于生物工程领域,公开了一种利用原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的多功能奶牛溶菌酶:包括奶牛溶菌酶、β‑乳球蛋白肽和EGFP绿色荧光标签融合蛋白,相比于传统毕赤氏酵母作为生物反应器,以原代奶牛乳腺上皮细胞作为生物反应器制备的溶菌酶的活性显著提高;所述的奶牛溶菌酶可极显著降低细菌对细胞的损伤,细胞凋亡率下降92.5%,可有效治疗细菌诱导的小鼠乳腺炎;奶牛溶菌酶可作为饲料添加剂,在胃的酸性环境中具有高构象稳定性,可消化分解微生物,分解后的组分被肠道吸收为自身的营养成分;所述奶牛溶菌酶含有特定的β‑乳球蛋白肽,可诱导对乳蛋白的口服免疫耐受,能够减轻牛乳蛋白过敏症的急性症状。CN115992116ACN115992116A权利要求书1/1页1.一种多功能奶牛溶菌酶,其特征在于,所述多功能奶牛溶菌酶由原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成,氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的多功能奶牛溶菌酶的制备方法,其特征在于,在序列为SEQIDNO:3的奶牛溶菌酶基因的5’端插入牛乳蛋白启动子元件,在牛乳蛋白启动子元件3’端插入β‑乳球蛋白肽基因序列,插入β‑乳球蛋白肽基因后的牛乳蛋白表达启动子元件序列如SEQIDNO:2所示。3.根据权利要求2所述的多功能奶牛溶菌酶的制备方法,其特征在于,采用携带增强型绿色荧光蛋白标签的哺乳细胞质粒为载体,将溶菌酶基因转染至原代乳腺上皮细胞中。4.根据权利要求2所述的多功能奶牛溶菌酶的制备方法,其特征在于,所述原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器的制备方法为:采集泌乳奶牛新鲜乳腺组织,分离腺泡组织并传代培养,得到单细胞悬液,分离原代奶牛乳腺上皮细胞,作为原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器。5.根据权利要求4所述的多功能奶牛溶菌酶的制备方法,其特征在于,培养奶牛乳腺上皮细胞过程中,根据成纤维细胞与乳腺上皮细胞二者贴壁速度的不同逐渐将成纤维细胞从乳腺上皮细胞中去除。6.根据权利要求4所述的多功能奶牛溶菌酶的制备方法,其特征在于,传代培养40分钟后将含细胞的培养液更换一个培养瓶,留在老瓶内的多为成纤维细胞,如此经过4代得到纯化的原代乳腺上皮细胞。7.根据权利要求1所述的多功能奶牛溶菌酶在制备动物抗菌药物或牛乳蛋白过敏药物中的应用。8.根据权利要求1所述的多功能奶牛溶菌酶在饲料添加剂中的应用。9.根据权利要求1所述的多功能奶牛溶菌酶在食品保鲜中的应用。10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,在巴氏杀菌后向奶制品中添加权利要求1所述的多功能奶牛溶菌酶。2CN115992116A说明书1/11页一种多功能奶牛溶菌酶及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于生物工程领域,更具体地说,本发明涉及一种原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的多功能奶牛溶菌酶及其制备方法和应用。背景技术[0002]奶牛溶菌酶(LYZ)作为存在于奶牛体液及组织中的固有免疫因子,是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶,具有杀菌免疫功能。主要通过破坏细胞壁中的N‑乙酰胞壁酸和N‑乙酰氨基葡糖之间的β‑1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。奶牛溶菌酶除了具有传统的抗菌作用,还具有消化功能,存在于奶牛消化系统的溶菌酶含量远高于其他组织。奶牛溶菌酶在酸性环境中具有高构象稳定性,能抗胃蛋白酶(pepsin)的消化拆解,使其在酸性pH环境中具有最佳活性,在胃中消化分解细菌,消化成分被小肠吸收。[0003]奶牛乳腺炎是奶牛常见病和多发病,随着奶牛乳腺炎发