一种鹿角胶特征图谱的构建方法及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116008409A(43)申请公布日2023.04.25(21)申请号202211211276.5C12P21/06(2006.01)(22)申请日2022.09.30(71)申请人山东省食品药品检验研究院地址250101山东省济南市高新技术开发区新泺大街2749号(72)发明人林永强薛菲焦阳马双成程显隆王志斌(74)专利代理机构济南泉城专利商标事务所37218专利代理师陈娟(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/72(2006.01)G01N30/86(2006.01)G01N33/68(2006.01)权利要求书3页说明书8页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称一种鹿角胶特征图谱的构建方法及其应用(57)摘要本发明属于中药质量控制领域，具体涉及一种鹿角胶特征图谱的构建方法及其应用。本发明通过以下方法实现：首先制备样品，然后通过分析后得到马鹿、梅花鹿、驼鹿、驯鹿、白尾鹿鹿角胶多肽质谱数据，将质谱数据转化为肽段序列，并进行统计学分析；选择相对专属的肽段作为特征多肽，采用超高效液相‑三重四级杆质谱联用的检测方法，靶向采集特征离子，验证特征多肽的专属性；选择在马鹿、梅花鹿鹿角胶中存在，其他易掺伪品种不存在的特征多肽，使用梅花鹿和马鹿的鹿角胶作为对照参照物建立鹿角胶特征图谱。本发明通过超高效液相‑三重四级杆质谱建立了鹿角胶特征图谱的策略，能够有效的评价鹿角胶的质量，且分析时间短，操作简单。CN116008409ACN116008409A权利要求书1/3页1.一种鹿角胶特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）样品制备：分别将马鹿、梅花鹿、驼鹿、驯鹿、白尾鹿的鹿角胶粉碎，取粉末，精密称定，精密加入碳酸氢胺溶液，超声，用微孔滤膜过滤，取续滤液，加牛胰蛋白酶溶液，酶解过夜，取出放冷至室温，离心，取上清液；（2）将上清液通过纳升液相色谱‑高分辨质谱分析后，得到马鹿、梅花鹿、驼鹿、驯鹿、白尾鹿鹿角胶多肽质谱数据；（3）将质谱数据转化为肽段序列，并进行统计学分析；（4）选择相对专属的肽段作为特征多肽，采用超高效液相‑三重四级杆质谱联用的检测方法，靶向采集特征离子，验证特征多肽的专属性；（5）将选择的特征肽段进行人工合成，合成后的肽段和鹿角胶样品分别进入超高效液相‑三重四级杆质谱进行分析，验证出峰时间是否一致；同时，将合成的特征肽段加入鹿角胶样品中，进入超高效液相‑三重四级杆质谱分析，验证出峰个数；当合成的特征肽段与鹿角胶样品出峰时间一致且加标的样品只出一个峰时，认为该特征肽段的序列与样品中序列一致；（6）选择在马鹿、梅花鹿鹿角胶中存在，其他易掺伪品种不存在的特征多肽，选择响应较高的子离子作为定量离子与定性离子，使用梅花鹿和马鹿的鹿角胶作为对照参照物建立鹿角胶特征图谱；（7）使用鹿角胶对照药材制备对照药材参照物溶液，将对照药材参照溶液与样品同时进入超高效液相‑三重四级杆质谱分析使用特征图谱特征肽段离子定向采集，供试品色谱中应呈现与对照药材参照物色谱相对应的6个特征峰，且应分别与相应对照药材参照物峰的保留时间相对应。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述样品制备具体过程为：将鹿角胶粉碎，取粉末20mg，精密称定，精密加入5ml25mM碳酸氢胺溶液，超声30分钟，用微孔滤膜过滤，取续滤液95μL，加浓度为10mg/ml的牛胰蛋白酶溶液5μL，37℃酶解过夜，取出放冷至室温，取上清液。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述纳升液相色谱‑高分辨质谱的检测条件为：使用100μm×3.5cm，粒径5μm的C18柱进行样品的脱盐富集，使用75μm×15cm，粒径为3μm的C18柱进行样品分离，流动相的流速为300nL/min，流动相A为2%乙腈的0.1%甲酸水溶液，流动相B为含98%乙腈的0.1%甲酸水溶液，进行梯度洗脱，进样量为1μL；高分辨质谱条件：离子源为NanosprayFlex离子源，正离子模式进行分析，喷雾电压为1800V，离子传输毛细管温度为275℃，S‑Lens传输效率为60%；一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60000，采集范围为350～1550（m/z）；二级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，采用RapidScan模式进行扫描，利用Top20数据依赖模式进行母离子选择，采用HCD模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为40%。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱为：0～1min,1%B→6%B;1～96min,6%B→22%B;96～113min,22%B→30%B;113～117min,30%B→95%B;117～120min,9