核酸测序的改进方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN104160040104160040A(43)申请公布日2014.11.19(21)申请号201380012596.0代理人王思琪郑霞(22)申请日2013.03.06(51)Int.Cl.(30)优先权数据C12Q1/68(2006.01)61/607,4182012.03.06US(85)PCT国际申请进入国家阶段日2014.09.04(86)PCT国际申请的申请数据PCT/EP2013/0545172013.03.06(87)PCT国际申请的公布数据WO2013/131962EN2013.09.12(71)申请人伊鲁米纳剑桥有限公司地址英国艾塞克斯(72)发明人尼尔·安东尼·葛姆雷路易斯·弗雷泽保拉·科克-冈萨雷斯(74)专利代理机构北京安信方达知识产权代理权利要求书2页权利要求书2页说明书24页说明书24页有限公司11262序列表2页序列表2页附图9页附图9页(54)发明名称核酸测序的改进方法(57)摘要本文提供一种使用转座来改进RNA分子测序方法的方法。本文提供了一种将核酸双链体，如DNA:RNA双链体或DNA:DNA双链体加标签的方法。该方法包括以下步骤：提供转座酶和转座子组合物，提供固定在支持物上的一个或更多个核酸双链体，并使所述转座酶和转座子组合物与一个或更多个核酸双链体在其中一个或更多个核酸双链体与转座子组合物进行转座反应的条件下接触，以产生一个或更多个加标签的核酸双链体，其中所述转座子组合物包含包含转移链和非转移链的双链核酸分子。CN104160040ACN1046ACN104160040A权利要求书1/2页1.一种将核酸双链体加标签的方法，包括以下步骤：(a)提供转座酶和转座子组合物；(b)提供固定在支持物上的一种或更多种核酸双链体；和(C)使所述转座酶和转座子组合物与所述一种或更多种核酸双链体在其中所述一种或更多种核酸双链体与所述转座子组合物进行转座反应的条件下接触，以产生一种或更多种加标签的核酸双链体，其中所述转座子组合物包含包含转移链和非转移链的双链核酸分子。2.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或更多种核酸双链体是DNA:RNA双链体，并且其中所述DNA:RNA双链体在RNA链的5'末端上被加标签。3.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸双链体是DNA:DNA双链体，并且其中所述DNA:DNA双链体的一条链在该DNA链的5'末端被加标签。4.如权利要求1至3中所述的方法，其中所述支持物包含多个固定的引物。5.如权利要求4所述的方法，其中所述一种或更多种DNA:RNA双链体的所述RNA链或所述DNA:DNA双链体的所述DNA链包括与所述固定的引物中的一种或更多种的至少一部分互补的序列。6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述DNA:RNA双链体或所述DNA:DNA双链体通过以下提供：使一种或更多种RNA分子或单链DNA分子与所述支持物上所述固定的引物杂交，并利用所述RNA分子或单链DNA分子作为模板使杂交到所述RNA分子或单链DNA分子上的引物延伸，以产生所述一种或更多种DNA:RNA双链体或DNA:DNA双链体。7.如权利要求4或5所述的方法，其中多个DNA:RNA双链体或DNA:DNA双链体通过以下提供：使多个RNA分子或单链DNA分子与所述支持物上所述固定的引物杂交，并利用所述RNA分子或单链DNA分子作为模板使杂交到所述RNA分子或单链DNA分子上的引物延伸，以产生所述多个DNA:RNA双链体或DNA:DNA分子。8.如权利要求4-7中任一项所述的方法，其中所述固定的引物包含polyT序列。9.如权利要求4所述的方法，其中所述多个固定的引物包含第一序列的第一引物子集和第二序列的第二引物子集。10.如权利要求9所述的方法，其中所述第一引物子集包含polyT序列。11.如权利要求4所述的方法，其中所述多个固定的引物包含能够与所述多个RNA分子中的一种或更多种RNA分子杂交的靶标特异性引物。12.如权利要求4所述的方法，还包括将3'衔接子添加到所述多个RNA分子或单链DNA分子上，所述3'衔接子包含与所述多个固定的引物或其子集互补的序列；并且使3’衔接子连接的RNA分子或单链DNA分子与所述固定的引物杂交。13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述转座反应产生5'加标签的RNA链或5'加标签的DNA链，所述5'加标签的RNA链或5'加标签的DNA链包含所述转座子组合物的转移链和互补DNA链的3'末端与所述转座子组合物的非转移链之间的缺口。14.如权利要求13所述的方法，还包括使所述一个或更多个加标签的DNA:RNA双链体或DNA:DNA双链体与核酸修饰酶在使所述DNA链的3'末端延伸的条