连接的核酸的纳米孔测序方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109312401A(43)申请公布日2019.02.05(21)申请号201780032978.8(74)专利代理机构北京同立钧成知识产权代理有限公司1(22)申请日2017.05.251205代理人关浩臧建明(30)优先权数据1609221.52016.05.25GB(51)Int.Cl.C12Q1/6869(2018.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日2018.11.26(86)PCT国际申请的申请数据PCT/GB2017/0514932017.05.25(87)PCT国际申请的公布数据WO2017/203269EN2017.11.30(71)申请人牛津纳米孔技术公司地址英国牛津郡(72)发明人安德鲁·约翰·赫伦丹尼尔·赖安·加拉尔达权利要求书3页说明书47页詹姆斯·怀特序列表46页附图11页(54)发明名称连接的核酸的纳米孔测序方法(57)摘要本发明涉及使用孔表征两种或更多种靶多核苷酸的新方法。该方法包括将一个或多个后续多核苷酸顺序连接到第一多核苷酸上以形成连接的多核苷酸。CN109312401ACN109312401A权利要求书1/3页1.一种表征两种或更多种靶多核苷酸的方法，包括：(a)使第一靶多核苷酸与膜中的跨膜孔接触，使得第一靶多核苷酸移动通过孔；(b)顺序地将一种或多种后续靶多核苷酸连接到第一靶多核苷酸上以提供连接的多核苷酸，在其中靶多核苷酸以连接顺序移动通过孔，其中在前靶多核苷酸移动通过孔时后续靶多核苷酸以连接顺序选择性地连接到所述前靶多核苷酸上；和(c)进行一次或多次测量，其指示所述连接的多核苷酸相对于孔移动时的一种或多种特征。2.根据权利要求1所述的方法，其中2种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、500种或更多种、1,000种或更多种、5,000种或更多种、10,000种或更多种、50,000种或更多种、100,000种或更多种、500,000种或更多种、1,000,000种或更多种、或5,000,000种或更多种后续靶多核苷酸与第一靶多核苷酸连接。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中最初保护前靶多核苷酸的一部分不与后续靶多核苷酸连接，并且当所述前靶多核苷酸移动通过孔时显露其用于连接。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中后续靶多核苷酸的一部分选择性地与前多核苷酸的一部分杂交。5.根据权利要求4所述的方法，其中首先保护前靶多核苷酸的一部分免于与后续靶多核苷酸的部分杂交，并且当前靶多核苷酸移动通过孔时显露其用于杂交。6.根据权利要求5所述的方法，其中前靶多核苷酸是双链的，其中前靶多核苷酸的部分在一条链中并与另一条链杂交，并且其中随着前靶多核苷酸移动通过孔，两条链分离时显露所述部分用于杂交。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述双链前靶多核苷酸的两条链在一端通过发夹环连接。8.根据权利要求7所述的方法，其中在前靶多核苷酸的另一端的另一条链包含优先穿入孔中的前导序列。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述后续靶多核苷酸在所述前靶多核苷酸的另一端与所述一条链连接。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述后续靶多核苷酸是双链的，并且两条链在一端通过发夹环连接。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述后续靶多核苷酸的另一端选择性地连接于所述前靶多核苷酸。12.根据权利要求10所述的方法，其中后续靶多核苷酸的另一端包含能够选择性连接前靶多核苷酸的前导序列。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在它们中的至少一种不移动通过孔的情况下两种不同的后续靶多核苷酸不能彼此连接。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种后续靶多核苷酸选择性共价连接至第一靶多核苷酸。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种后续靶多核苷酸通过连接酶、拓扑异构酶或通过点击化学选择性连接至第一靶多核苷酸。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中连接的多核苷酸通过孔的运动由分2CN109312401A权利要求书2/3页子刹车控制。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述分子刹车是或衍生自聚合酶、解旋酶或核酸外切酶。18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述分子刹车在其与跨膜孔接触之前与第一靶多核苷酸结合，并且蛋白质控制整个连接的多核苷酸通过孔的运动。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种后续多核苷酸在它们与第一靶多核苷酸连接之前不具有与它们结合的分子刹车。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一靶多核苷酸和/或所述一个或多个后续靶多核苷酸包含一个或多个能够将所述多核苷酸偶联至所述膜的锚。21.根据前述权利要