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本发明公开了一种鼠李糖脂衍生物的制备方法及其抑菌应用。该衍生物基于鼠李糖脂的脂肪酸链末端羧基与L?精氨酸甲酯二盐酸盐(H?Arg?OMe)通过缩合反应制得。所述鼠李糖脂为铜绿假单胞菌发酵生产的糖脂类生物表面活性剂,可以是单鼠李糖脂或双鼠李糖脂,也可以是两者的混合物。本发明提供的方法可高效制备新型的鼠李糖脂?精氨酸盐衍生物(Arg?RLs),为鼠李糖脂的衍生化提供了新方案,也有助于开发鼠李糖脂衍生物的生物抑菌新应用。