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本发明涉及粪便微生物检测领域,具体而言,涉及一种粪便保存液及其制备方法和应用。一种粪便保存液,所述粪便保存液的溶剂为水,以所述粪便保存液的体积计,各组分的浓度如下:乙二胺四乙酸9?13g/L,异硫氰酸胍400?600g/L,1MTris?HCl(pH=7?10)体积百分数为8%?10%,氯化钠7?10g/L,山梨醇50?80g/L,十二烷基硫酸钠20?40g/L。该粪便保存液实现了粪便样本的常温保存以及随时随地的采集粪便样本,并且提高了每个菌属微生物DNA的稳定性以及保存时间,而且便于长途运输。