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本发明公开了一种美洲鲥鱼雄性分子标记及其特异性引物对和应用。本发明首次获得了一段能够鉴别美洲鲥鱼雄性标记分子,而且基于该标记分子进一步获得了能够扩增该标记分子的特异性引物及其相应的试剂盒,该特异性引物及其试剂盒能够准确地区分遗传性雄鱼(xy雄鱼)和生理性雄鱼(即xx假雄鱼);本发明采用从尾鳍条提取DNA方法提供了一种无创鉴别美洲鲥鱼雌雄的DNA标记方法,对美洲鲥鱼进行遗传性别鉴定,而且可以在鱼苗或幼鱼阶段进行性别鉴定,使用高通量扩增检测方法,可完成大批量样本的性别鉴定;本发明操作简便,节省成本,本发明的引物对鲥鱼性别鉴定的准确度为100%。