质粒DNA提取试剂盒-柱式(Column.doc

技术咨询电话：400-607-9999注意：本制品仅供研究使用，请勿用于临床治疗等其他用途质粒DNA提取试剂盒-柱式(ColumnPlasmidDNAout)货号:M090114产品及特点:本试剂盒是用于质粒DNA小量制备与纯化的试剂盒。试剂盒采用了传统的SDS碱裂解法，结合先进的硅胶膜DNA吸附和玻璃奶DNA吸附技术，高效快速提取质粒DNA。本产品是国内外唯一的硅胶膜/玻璃奶双抽产品。快速、步骤少，整个操作在半个小时之内完成。纯度高，采用本试剂盒提取的质粒OD比值在1.8-2.0之间。产量高，每毫升过夜培养的细菌可以提取到2-5ug/mL。用途广，适用于低拷贝和高拷贝质粒。价格低，比多数国内同类产品的价格更便宜。规格及成分成份100次包装溶液A26mL溶液B26mL溶液C36mLRNaseA溶液（10mg/mL）1.5mL通用洗脱液10mL通用洗柱液100mL高载量离心吸附柱100套使用手册1份运输及保存:常温运输和保存。使用方法先将全部RNaseA溶液全部加入到溶液A中，摇匀后再取用，未用完的溶液A最好在4℃保存。从筛选平板上挑取单菌落至含抗生素的培养基中，37℃震荡培养12-16小时（摇床转速200-300）。注意：建议使用LB培养基，营养更丰富的培养基会使菌体浓度过高，超过纯化系统处理能力而降低DNA质量。另外，延长培养时间有利于提高质粒DNA浓度，但是菌液培养过长时间会因细胞死亡、裂解而造成质粒DNA浓度降低。用1.5mL离心管收集1-4mL过夜培养饱和菌液，室温12,000rpm离心1分钟，弃上清，再短暂离心，吸弃残留液体。将250uL溶液A和15uLRNaseA混合，用枪头充分吹打使菌体重悬。(也可以先将全部RNaseA溶液全部加入到13mL溶液A中，摇匀后再取用，未用完的溶液A最好在4℃保存)。注意：细胞未充分悬浮会影响后续操作，可以使用漩涡振荡器帮助混匀或使用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀。加入250uL溶液B（如果溶液B有沉淀，用前须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用），温和反复颠倒混匀4-6次，看到溶液变粘即可。注意：此步处理不能超过5分钟，否则DNA的碱损伤比较严重。千万不要剧烈振荡，否则基因组DNA断裂产生的片段非常容易污染质粒DNA。溶液B用后需要将盖拧紧存放，否则空气中的二氧化碳会进入溶液，形成碳酸，中和溶液B中的NaOH，降低其效率）。加入350uL溶液C，反复颠倒混匀4-6次，可见白色沉淀物产生，然后放冰上放置2分钟。注意：室温放置请勿超过5分钟，防止损伤质粒。室温最高转速（12,000rpm以上）离心5分钟，小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大，有时候出现沉淀漂浮是正常现象，取上清时避开漂浮的沉淀即可）。静置2分钟以让质粒DNA与吸附柱充分结合，此步十分重要。室温12,000rpm离心1分钟，弃收集管中的废液。加入500uL的通用洗柱液，室温12,000rpm离心1分钟，弃收集管中废液。注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要将盖拧紧存放，否则乙醇会挥发。重复上步1次。室温12,000rpm离心1分钟，甩干残留液体。此步不能省略，否则残留乙醇会影响DNA的后续使用（如DNA上样时不能沉淀到加样孔中）。将离心吸附柱置于一个新的1.5mL塑料离心管（自备）中，加入30-100uL65-80℃预热的DNA洗脱液，室温放置2分钟。常温的DNA洗脱液也可以用于洗脱，但产量稍微有所降低。室温12,000rpm离心1分钟，离心管底溶液即质粒DNA。由于本公司的吸附柱结合DNA能力较强，如果再加适量DNA洗脱液到离心吸附柱中，往往还能洗脱下很多质粒DNA（相当于第一次洗脱的20-30%），但注意不要使用上步得到的DNA洗脱液来洗脱。疑难解答可能出现的问题可能原因建议解决方法琼脂糖凝胶上可见RNA帶RNA降解不彻底适当补加点RNase到溶液A中产物中有大分子量的DNA污染加入溶液B后有剧烈震荡或裂解时间过长加入溶液B后不要猛烈振荡或搖匀，可轻轻颠倒离心管6-8次使充分混匀,并且时间一般在5分钟之内。在琼脂糖凝胶上点样时，质粒漂出点样孔洗脱步骤后，乙醇没有完全从柱子上去除DNA洗脱前离心柱必须干甩一次。DNA产量低菌体量过多细菌裂解率低只使用含有氨苄青霉素的LB或YT培养基.使用时，不要使用超过4mL的高拷贝质粒培养物或8mL低拷贝质粒培养物(一般用过夜培养物1.5mL)。在加入溶液A后细胞没有充分混匀，可漩渦振荡悬浮液使之充分混匀。加入溶液B后，延长裂解时间,使裂解液澄清即可,一般不会超过5分钟。如果溶液B没有盖紧，可能需要重配.可按以下准备：0.2NNaOH，1%SDS。使用的是低拷贝数质粒若5mL过夜培养物的产量小于0.5μg，增加培养物的体积至10ml.