大米免疫活性肽的制备及分离纯化.doc

大米免疫活性肽的制备及分离纯化2012-2013年我国稻谷总产量保持在2亿吨左右,居世界首位。在稻米各加工领域,每年产生了大量的碎米、米渣、米糠副产物。相比其他含有过敏和抗营养因子的植物蛋白,大米蛋白不仅氨基酸组成平衡合理,并且还不失为一种重要的低抗原性蛋白资源,适宜用作开发婴幼儿食品和特殊人群营养食品的基料。老龄化、肥胖症、睡眠时间或质量下降、吸烟与饮酒等不良生活习惯皆可能导致机体免疫力下降而引发各种疾病,寻求适宜的免疫调节剂来提高人体免疫能力成为了人类社会迫切的需要。利用碎米、米渣等大米加工副产物为原料,采用酶法制备大米免疫活性肽,不仅可大大提高大米加工副产物的附加值,同时还可为婴幼儿和免疫力低下的人群提供低过敏性的免疫调节剂,具有重要的社会效益和较高的经济效益。本研究从4种商品蛋白酶中确定了制备大米免疫活性肽(Riceimmuno-activityPeptideRIAP)的最适水解酶为碱性蛋白酶Alcalase2.4L,以水解度DH为考察指标,考察了时间、温度、pH、加酶量与底物浓度对DH的影响,单因素实验得到的较优酶解工艺条件为：底物浓度5%、加酶量2800U/g、pH8.0、酶解温度60℃、酶解时间3h,此条件下制备的RIAP的DH为23.21%；以DH和巨噬细胞增殖指数SI为考察指标,采用正交实验优化的最佳酶解工艺条件为：底物浓度6%、加酶量2600U/g、pH7.8、酶解温度60℃、酶解时间3h,在最佳酶解工艺条件下制备的RIAP的DH与SI值分别为22.04%与1.453；其相对分子质量处于180-1000Da之间的肽段比例为78.39%,相对分子质量低于180Da的肽段比例仅占3.36%；从氨基酸组成分析可知,RIAP中疏水性氨基酸Ala、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Pro、Trp的含量为30.12%,其疏水性Q值为4.94KJ/mol,碱性氨基酸所占比例达到11.84%。研究了大孔吸附树脂对RIAP的脱盐和分离效果。采用DA201-C大孔吸附树脂进行了大米免疫活性肽的静态、动态吸附与解吸实验,静态吸附、解吸实验表明：当样品浓度为30mg/mL时,12h后样品吸附量为317.92mg/mL,90%乙醇的解吸率为79.78%；动态吸附、解吸实验表明：浓度为30mg/mL.(含0.4mol/LNaCl)的大米免疫活性肽以0.5BV/h流速上样、2BV/h的流速水洗、1.5mL/min的70%的乙醇解吸后,其脱盐率为74.47%、解吸率为86.00%,纯度提高了13.55%；利用不同浓度的乙醇按疏水性强弱对大米免疫活性肽进行了分离纯化,乙醇洗脱组分疏水性氨基酸摩尔百分比从RIAP-A的37.60%递增到RIAP-D的42.95%,疏水性Q值也从RIAP-A的5.09KJ/mol递增到RIAP-D的5.96KJ/mol,说明可利用不同浓度乙醇将RIAP按疏水性大小进行初步分离纯化；55%乙醇洗脱组分SI值为1.551,较其它乙醇洗脱组分高。据带电性质的不同研究了离子交换树脂对大米免疫活性肽的分离纯化效果。分别考察了DEAE-SepharoseFastFlow弱阴离子交换树脂和201×7型强阴离子交换树脂对大米免疫活性肽的分离纯化效果,采用DEAE-SepharoseFastFlow弱阴离子交换树脂分离纯化大米免疫活性肽,穿透峰SI为1.697,较201×7强阴离子交换树脂分离组分的活性强,得率为44.50%；采用201×7型强阴离子交换树脂分离纯化大米免疫活性肽,0.1NHC1的洗脱峰SI值为1.649,比大孔吸附树脂55%乙醇洗脱组分的SI值大,得率为67.39%；虽然DEAE-SepharoseFastFlow弱阴离子交换树脂获得的组分活性较高,但201×7强阴离子交换树脂的得率较前者高51.44%,因此,本研究认为201×7强阴离子交换树脂对大米免疫活性肽的分离纯化效果更好。