大米抗氧化活性肽的分离纯化和性质研究.doc

大米抗氧化活性肽的分离纯化和性质研究自从Harman提出自由基理论以来,人们认识到人体内氧化产生的自由基与人体衰老和许多疾病有关,因此人们越来越关注抗氧化剂。但目前大多数抗氧化剂都是化学合成物,如叔丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)；这些化学类抗氧化剂虽然效果好,但是对人体具有潜在毒性。近年来,人们把目光转到天然性的抗氧化剂,如抗坏血酸、α-生育酚、茶多酚、大豆蛋白酶解得到的大豆肽等。近年来研究发现,大米源抗氧化活性肽(antixox-idativepeptide)也具有较强的抑制生物大分子过氧化和清除体内自由基的功能,而且这些抗氧化活性肽往往强于蛋白质和氨基酸,并且具有低毒、高效等特点,有望利用这些抗氧化活性肽开发新功能食品和保健品。本文对大米抗氧化活性肽的制备工艺进行了优化,通过响应面分析法优化了超声波处理工艺参数的最佳组合；通过不同的体外体系,研究大米碱性蛋白酶酶解产物的抗氧化活性,然后进一步分离和纯化,得到了几段抗氧化活性高的片段；并通过体外模拟人体消化,评价分析了消化对大米抗氧化活性肽抗氧化活性的影响。现将主要结果和结论归纳如下：1、选取超声功率、超声处理时间、超声处理初始温度做3因素3水平响应面分析实验,采用SAS程序对实验数据进行回归分析,得出模型中最佳提取工艺参数：超声功率1750W、超声处理时间30min、超声处理初始温度40℃,其DPPH·清除率预测可达到78.2%。对以上工艺参数进行验证实验,经3次平行测定,各抗氧化肽的DPPH·清除率分别为：76.0%、75.8%和77.4%,此时抗氧化肽的浓度分别为1.5037、1.5163和1.5085mg/mL,DPPH清除率的平均值为76.4%,抗氧化肽的平均浓度为1.5095mg/mL,实验结果较理想。在优化工艺条件下,抗氧化肽得率由31.6%提高到42.2%。2、本章采用了5种抗氧化活性检测的方法,其中包含了脂类物质氧化抑制能力的方法、清除自由基能力的方法和还原能力的测定方法,较全面地反映了大米多肽的抗氧化能力。并和Vc的抗氧化能力做了比较,在高浓度20.00～50.00mg/mL,大米多肽和Vc对·OH清除能力相当,但是在其他浓度和清除其他自由基的情况时,大米多肽的能力都低于Vc。总的来说,大米多肽的抗氧化能力在一定范围内,与浓度呈一定的量效比。3、使用葡聚糖凝胶SephadexG-25初步分离纯化后,发现分子量在132.7-1153.9的小肽占得相当大的比例,为下一步纯化分离打下了基础。4、利用SP-SephadexC-25作为离子交换层析介质,pH4.0,0.02mol/LHAc-NaAc为起始缓冲液,流速120mL/h,NaCl(0～1mol/L)梯度洗脱,大米碱性蛋白酶水解产物NHREP得到了较好的分离,混合肽组分被分离出七个组分(A-G),组分F的DPPH·清除能力最强(80.09±1.22%)。5、利用SephadexG-15凝胶色谱又将组分F分成了4个组分F1、F2、F3和F4。并分别检测了各组分的DPPH·清除能力。结果发现,组分F3表现出最强的DPPH·清除能力(达到77.64%)。组分F3经RP-HPLC分离后,分成五个主要组分,其中组分F3b的DPPH·清除能力最强,达到了89.53%；组分F3c次之,其对DPPH·的清除能力为76.21%。6、通过体外模拟人体消化过程,测定大米活性多肽清除DPPH·的能力,来评价体外模拟人体消化过程对大米多肽抗氧化能力影响的情况。经过人体模拟消化后,最后在透析液中,大米多肽清除DPPH·的清除率最高可以达到45.53%。这为后续大米多肽在体内实验提供了良好的基础,并建立了大米多肽体外模拟消化的实验流程图。