尼古丁诱导肺癌干细胞EMT并促进其侵袭转移.doc

尼古丁诱导肺癌干细胞EMT并促进其侵袭转移背景与目的:近年来,尽管肺癌的检查和治疗手段取得了巨大进步,但其死亡率一直高居不下,肺癌仍然是人类目前死亡率最高的肿瘤之一,原因之一是治疗后的复发、转移及治疗的耐药性不能很好的解决。肿瘤干细胞(CSCs)是肿瘤细胞群体中一小部分具有自我更新及多向分化能力,并且具有高度的侵袭和转移能力等特性的细胞。CSCs学说认为肺癌干细胞(LCSC)参与肺癌的癌变、发生发展、侵袭转移、肿瘤耐药、以及肿瘤的复发等各个过程。另有研究发现上皮间质转化(EMT)同样能够增加肿瘤的侵袭和转移能力,并且可以增加肿瘤细胞的干细胞特性,这也许是两者关系密切的重要证据。尼古丁作为烟草中重要化学物质,能够诱导包括肺癌在内的多种人类癌细胞的EMT和促进侵袭转移。尼古丁诱导侵袭和EMT的过程可能是肺癌发生耐药和转移的重要机制,可能对肺癌干细胞能够产生同样的作用。阐明EMT相关信号通路与LCSC相互作用机制,有望为吸烟肺癌患者的后续治疗开辟新途径。本研究目的主要是富集肺癌干细胞,检测其干细胞特性,并探索尼古丁诱导的EMT对肺癌干细胞的作用,为后续进一步分子机制研究奠定基础。材料与方法:(1)以人肺腺癌A549细胞株为研究对象;(2)应用划痕实验和Transwell侵袭实验研究不同浓度尼古丁对肺癌细胞株迁移和侵袭能力的作用;(3)通过使用Real-timePCR和Westernblot方法研究尼古丁对肺癌细胞EMT相关表面标志物mRNA和蛋白水平的影响;(4)通过免疫荧光技术检测尼古丁诱导肺癌细胞EMT,发生β-catenin蛋白表达核转移;(5)使用无血清悬浮培养法富集肺癌细胞球细胞;(6)应用流式细胞仪检测侧群细胞(SP)在细胞球细胞和亲代肺癌细胞间的含量差异;(7)应用流式细胞仪检测CD133在细胞球细胞和亲代肺癌细胞中表达差异;(8)应用Real-timePCR技术检测细胞球细胞和亲代肺癌细胞株中ABCG2和CD133的mRNA表达水平差异,Westernblot方法检测细胞球细胞和亲代肺癌细胞株中ABCG2蛋白表达差异;(9)流式细胞术检测细胞球细胞和亲代肺癌细胞株中的细胞周期差异;(10)应用CCK8法测定顺铂对肺癌细胞球细胞和亲代肺癌细胞株的半数抑制浓度(IC50),绘制浓度-抑制率回归曲线;(11)应用Transwell侵袭实验比较细胞球细胞和亲代肺癌细胞株体外侵袭能力差异;(12)应用Real-timePCR和Westernblot方法研究尼古丁对细胞球细胞EMT相关表面标志物mRNA和蛋白水平的影响;(13)通过Transwell侵袭实验研究尼古丁对细胞球细胞侵袭能力的影响;结果:(1)0.1、1、10μmol/L尼古丁处理肺癌细胞株24h、48h后进入划痕区域细胞数量较0μmol/L组显著增多,划痕区域面积明显缩小,经方差分析尼古丁处理组迁移能力显著高于未处理组(P=0.000)。(2)1μmol/L和0μmol/L尼古丁处理细胞后,Transwell侵袭实验穿过基底膜的肺癌细胞数量为:106±2和67±2,尼古丁处理组细胞侵袭能力显著增强(P=0.000)。(3)尼古丁处理肺癌细胞株48h后,E-cadherin表达下调,Vimentin表达上调。0.1、1、10μmol/L尼古丁处理的肺癌细胞后,E-cadherinmRNA表达(0.81±0.03,0.49±0.01,0.39±0.05)低于未处理组细胞(1.00±0.12),与未处理组E-cadherinmRNA表达水平的2-ΔΔCT值比较有显著性差异(P=0.000,0.000,0.000);0.1、1、10μmol/L尼古丁处理肺癌细胞后,VimentinmRNA表达(1.64±0.07,2.03±0.06,2.35±0.10)明显高于未处理组细胞(1.00±0.12),与未处理组VimentinmRNA表达水平的2-ΔΔCT值比较有显著性差异(P=0.000,0.000,0.000);0.1、1、10μmol/L尼古丁处理后,E-cadherin蛋白表达(0.27±0.002,0.25±0.005,0.18±0.003)低于未处理组细胞(0.30±0.003),与未处理组E-cadherin蛋白表达水平的灰度比值比较有显著性差异(P=0.000,0.000,0.000);0.1、1、10μmol/L尼古丁处理后,Vimentin蛋白表达(0.52±0.008,0.86±0.005,1.14±0.010)高于未处理组细胞(0.37±0.005),与未处理组Vimentin蛋白表达水平的灰度比值比较有显著性差异(P=0.022,0.000,0.000);1μmol/L尼古丁处理24,48,72h的肺癌细胞组E-cadherin蛋白表达(0.47±0