几丁质酶(Chitinase)基因转化小麦的研究.doc

几丁质酶(Chitinase)基因转化小麦的研究本研究利用基因枪法、农杆菌法和花粉管通道法，首次将菜豆几丁质酶基因导入春小麦东农7742中，同时对转基因的表达和遗传进行了分析，对转基因植株的抗病性进行了观察。对影响转化的各种因素和转基因小麦研究中存在的问题提出了自己的见解。主要研究结果如下：1.利用PDS1000/He型高压氦气基因枪，以携带菜豆几丁质酶基因的质粒DNA轰击小麦萌动幼胚8139块，在东农7742To代获得经PCR扩增和PCR-Southern杂交证实的转基因小麦植株7株，转基因植株分属4个不同轰击参数的组合，转化率分别为0.56％、0.36％、0.20％和0.35％；利用农杆菌介导法和利用基因枪与农杆菌协同转化法转化东农7742小麦幼胚愈伤，共感染外植体1546块，获得转化愈伤组织的频率分别为0.46％和0.32％，但转化愈伤未能再生植株；利用花粉管通道法将菜豆几丁质酶基因导入小麦东农7742，共操作小花385个，获得2株转化植株，转化率为0.52%；三种转化方法各有特点，对于组织培养再生频率高的基因型适合用基因枪法或农杆菌法，对于组织培养再生性差的基因型适合用花粉管通道法。2.小麦幼胚愈伤组织胚性化快且质量好，是比幼穗或成熟胚更理想的转化受体。供试的三个小麦品种因不同基因型，幼胚愈伤组织再生频率差异明显，辽-10为7.84％，91B569为13.68％，东农7742为54.88％。小麦本身对选择剂卡那霉素有较高的天然抗性，采用G418对小麦幼胚愈伤组织进行筛选效果明显。G418的毒性作用有滞后特点，三个小麦品种对G418的敏感性依次为辽-10＞91B569＞东农7742。用G418做选择剂筛选辽-10、91B569和东农7742抗性愈伤的适合浓度分别为25mg/L、30mg/L和35mg/L。此外，不同轰击参数影响金粉分布的范围和密度，轰击距离比轰击压力影响大。轰击距离为6或9cm时，内部金粉密度大而外围金粉密度小，差异极大。相对而言，轰击距离为12cm时，内部和外围金粉密度差异小，均匀度好。3.对转基因植株To98-2，98-3，98-7自交产生的后代T₁植株进行的检测表明，转化株与非转化株的分离比分别为1∶2.3，1∶4，1∶4。此非盂德尔式分离说明To98-2，98-3，98-7不是由单一转化细胞再生而成或其它原因引起。采用氨基葡萄糖法对98To转基因植株及对照株叶片几丁质酶活性进行了测定，其中98-2，98-3，98-7的内切几丁质酶活性分别为29.78，34.69，30.39活力单位，对照植株为14.81活力单位。转基因植株内切几丁质酶活力是对照植株的2倍左右。表明35S启动子驱动的菜豆几丁质酶基因在转基因小麦中得到表达，但表达水平不高。对部分转基因植株及对照株感白粉病和赤霉病的情况进行了观察和统计，转基因植株感白粉病的总体情况与对照株没有明显差别。转基因植株感赤霉病的扩展程度存在个体差异，其中T87植株无扩展，T107植株扩展最重为70％，可能是转基因表达差异所致。