利用杜仲几丁质酶基因EuCHIT1创制抗锈病小麦新种质的研究.doc

利用杜仲几丁质酶基因EuCHIT1创制抗锈病小麦新种质的研究普通小麦(Triticumaestivum)是世界上总产量和栽培面积最大的三大粮食作物之一。小麦锈病是由担子菌亚门真菌引起的真菌性气传病害,是一种世界性重要病害。小麦感染锈病后,产量和品质均会下降。目前,小麦抗锈病品种的选育已经成为减少病害损失的主要途径,探索利用外源基因提高锈病抗性对小麦生产具有重要意义。本研究利用农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的遗传转化法将杜仲几丁质酶基因(Eucommiaulmoideschitodextrinasegene,EuCHIT1)遗传转化小麦品种“贵紫3”、“AVS”、“铭贤169”和“SY95-71”,通过?葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)组织化学染色和PCR鉴定筛选转基因植株,对转基因植株和野生型的农艺性状、几丁质酶活性、保护性酶活性、锈病抗性和病程相关蛋白基因相对表达量比较分析,取得以下研究结果:1、农杆菌介导小麦遗传转化本研究利用农杆菌介导小麦茎尖遗传转化法,将杜仲几丁质酶基因35S:EuCHIT1导入4个小麦品种(“贵紫3号”、“SY95-71”、“铭贤169”和“AVS”),筛选鉴定出小麦品种“AVS”T0代转基因植株25株,“铭贤169”T0代转基因植株20株,“SY95-71”T0代转基因植株24株,“贵紫3号”5株,将其中3个转基因植株(TP-1、TP-2和TP-3)繁殖获得T1代植株共51株。2、EuCHIT1基因表达对小麦农艺性状的影响将3个转EuCHIT1基因株系T1代植株及其野生型(“贵紫3号”)种植于田间,并对成熟期株高、旗叶长、旗叶宽、穗长、小穗数、穗粒数、千粒重等农艺性状进行了测定。结果表明,3个株系转基因植株与野生型农艺性状之间差异未达到显著水平,表明杜仲EuCHIT1基因表达对小麦的株高、穗长、千粒重等农艺性状没有造成明显的影响。3、EuCHIT1基因表达对小麦几丁质酶活性的影响对3个转EuCHIT1基因株系T1代植株及其野生型(“贵紫3号”)叶片的几丁质酶活性进行了测定。结果表明,转EuCHIT1基因植株几丁质酶活性平均为3328.63U/g(FW),野生型植株的几丁质酶酶活性为2340.72U/g(FW),转基因植株酶活比野生型高42.21%,差异达极显著水平。说明在组成型强启动子35S驱动杜仲EuCHIT1基因在小麦品种“贵紫3号”中超量表达,提高了几丁质酶的活性。4、EuCHIT1基因表达对小麦条锈病抗性的影响对转EuCHIT1基因T1代植株和野生型(“贵紫3号”)叶片接种小麦条锈菌后,观察其发病情况并进行条锈病抗性鉴定,结果表明,接种5d后,野生型植株叶片开始出现病症,肉眼观察到条锈菌孢子,转基因小麦叶片在接菌后14d才出现病症,转基因植株叶片发病时间比野生型推迟9d,接种条锈菌14d后,条锈病抗性鉴定结果为:转基因植株最大严重度(Maximumdiseaseseverity,MDS)反应型(Infectiontype,IT)分别为5%、1;野生型植株严重度反应型为20%、3。接种14d后测定了小麦旗叶的病变长度,转基因植株旗叶平均病斑长度为4.50cm;野生型植株旗叶病斑长度为9.60cm,差异达到了极显著水平。说明EuCHIT1在小麦中的超量表达提高了小麦对条锈病的抗性。5、EuCHIT1基因表达对小麦对叶锈病抗性的影响对田间种植T0代转基因EuCHIT1植株及野生型(“AVS”、“铭贤169”和“SY95-71”)叶片接种小麦叶锈菌,当野生型品种充分发病时进行抗病鉴定。结果表明,转基因植株“SY95-71”、“铭贤169”和“AVS”的叶锈病平均最大严重度(Maximumdiseaseseverity,MDS)分别为62.00%、52.75%和58.50%,野生型3个品种分别为84.00%、68.50%和74.50%,转基因植株的MDS比野生型分别低35.4%、29.8%和27.3%。转基因植株平均病程曲线下面积(Areaunderthediseaseprogresscurve,AUDPC)分别为374.50、307.12和344.75,野生型3个品种分别为504.00、432.50和486.50,转基因植株的AUDPC分别比野生型低34.5%、40.7%和41.1%。野生型植株叶片叶锈菌孢子堆较大,且没有出现褪绿情况,反应型为4;大部分转基因植株虽然叶片叶锈病孢子大,但孢子堆周围出现了局部的褪绿现象,阻止了叶锈菌的扩散,反应型为3+。说明转EuCHIT1基因植株抑制叶锈病的病情扩散,提高了对叶锈病的抗性。6、EuCHIT1基因表达提高了小麦保护性酶的活性对未接种和接种条锈菌7d后3个转EuCHIT1基因株系及野生型(“贵紫3号”)叶片的