几丁质酶基因和几丁质酶—葡聚糖酶双价基因导入西瓜的研究.doc

几丁质酶基因和几丁质酶—葡聚糖酶双价基因导入西瓜的研究西瓜（Citrulluslanatus（Thunb.）Mansfeld（syn.C.vulgarisSchrad））是一种经济价值很高的世界性水果，但其病害种类繁多，尤以枯萎病等真菌性土传病害最为严重，是生产中存在的主要问题。由于西瓜遗传基础狭窄，抗病种质资源缺乏，抗病性遗传规律复杂而导致传统抗病育种进展缓慢。此外，病原微生物多态性强、变异广泛也是一个原因。目前植物抗病基因工程在一些重要物种的改良中取得了一定进展，但该技术在瓜类作物中的应用研究起步较晚，加之瓜类作物尤其是西瓜存在组培再生困难、试管苗移栽成活率低和遗传转化体系较难优化等问题，因而这方面的研究较为落后。本实验对西瓜组织培养体系进行了系统研究，优化了农杆菌介导的西瓜遗传转化体系。构建了含有番茄几丁质酶基因（Chi3）的植物表达载体及同时含有番茄几丁质酶基因（Chi3）和β-1，3-葡聚糖酶基因（Glu-Ac）的双价抗真菌基因植物表达载体，用于转化西瓜，成功的获得了转基因植株，并进行了相关分子生物学鉴定，期望可以从中筛选出抗病性增强的品种或供进一步研究利用的育种材料，同时也为此技术在其它作物中的应用提供有益的借鉴。主要结果和结论如下：1西瓜组织培养体系的建立1)茎尖与子叶块可直接分化不定芽；愈伤组织也可诱导不定芽分化，但频率很低；真叶和茎段诱导分化十分困难。2)建立了以西瓜子叶块和茎尖为外植体的不定芽直接分化体系，其最适培养基分别为MS+6-BA_{1.0+IBA_0.2和MS+6-BA_1.0+IBA_0.5在最适培养基上二者的不定芽诱导率分别可达81.4％和92.3％。3}不同基因型的诱导率有一定差异，但对于所有参试基因型而言，一定浓度的6-BA是诱导分化的关键，附加低浓度的IBA则有利于这种分化的发生，无激素培养基上的外植体未见发生不定芽的分化。4)无菌苗子叶呈浅绿色时的子叶块和茎尖最适合于不定芽的诱导，有最高的诱导率。5)西瓜再生植株生根较易，低浓度IAA(0.2mg·L^-1)即可较好的诱导形态正常、有明显根毛的不定根。NAA的诱导的不定根形态短粗，无正常根毛，移栽时易折断。福建农林人学博卜学位论文摘要2农杆菌介导遗传转化体系的优化l)西瓜子n一犷块外植体对潮霉素较为敏感，巧mg·L一’是适宜的筛选浓度;卡那霉素对外植体的生长和分化有明显的抑制作用，不定芽玻璃化严重，不适用于筛选。头抱霉素和按节青霉素只在高浓度时，使外植体的生长速度略有减慢，无其它明显影响，均可用于侵染后的脱菌过程。2)相对于根癌农杆菌菌株AGL一1、LBA44O4而言EHA105获得的瞬时表达率较高，在对西瓜的转化中可获得较高的转化率。3)预培养对于获得大小合适、形态正常的外植体是必要的。以EHA105为侵染菌时共培养时间以3一4d为宜，菌液浓度OD60。值在0.3左右转化效率最高，侵染时间以10min为最佳。3抗真菌基因植物表达载体的构建l)以植物双元质粒载体pCAMBIA1300和pBll21为基本元件，通过多次重组，构建含番茄几丁质酶基因（Chi3）的植物表达载体。2)以类似策略，通过多次重组，将独立克隆于载体pBlueseriPtn上的番茄几丁质酶基因（C}:13）cDNA片段和番茄p一l，3一葡聚糖酶基因（Glu一Ac）。DNA片段构建在同一植物表达载体中。上述两个目的基因均采用CaMV355Promoter作为启动子。4西瓜的遗传转化l)利用农杆菌法将番茄几丁质酶基因导入西瓜，并获得转基因植株。通过PCR、PCR一Southem和RT一PCR鉴定，表明外源基因己成功整合到西瓜基因组中，并获得表达。2)利用农杆菌法同时将番茄几丁质酶基因和番茄卜1，3一葡聚糖酶基因导入西瓜，并获得转基因植株。通过PCR、Southem和RT一PCR鉴定，表明外源撰因己成功整合到西瓜基因组中，并获得表达。3)对实验中获得的部分转基因植株，利用尖袍镰刀菌西瓜专化型，进行叶片细胞粗提液抑菌效果检测和离体n一卜片抗病性检测。实验结果表明转基因植株的抗病性有不同程度的增强。