几丁糖介导eNOS基因转移预防兔颈动脉球囊损伤后再狭窄的初步研究.doc

几丁糖介导eNOS基因转移预防兔颈动脉球囊损伤后再狭窄的初步研究基因治疗是心血管疾病治疗措施的重要组成部分。通常，基因载体分为两类：病毒载体和非病毒载体。腺病毒载体由于其转染能力强而被广泛应用，而且腺病毒载体介导人类血管床基因转移已经进行了小规模的临床试验。但是腺病毒载体有其自身的缺点：①在体内转染时，复制缺欠型腺病毒具有复原为致病性的野生型腺病毒的危险性。②腺病毒载体对目标细胞具有细胞毒性，细胞的活性和功能往往因感染腺病毒而发生改变；③机体对腺病毒可以产生免疫反应，注射后产生病毒中和抗体。而且，抗体的产生和原有抗体的水平有明显相关性，因此，腺病毒载体不能反复使用。④载体构建过程复杂，耗时长，耗资大。⑤全身应用时远位器官的不良反应。由于腺病毒载体的这些特点，它的实际应用受到许多限制。而相比之下，非病毒载体具有许多明显的优势，如价格低廉、无致炎性和免疫原性、良好的生物相容性，安全性高，而且根据需要可反复应用。非病毒载体有许多可供选择的材料，如阳离子脂质体、阳离子类脂质体和聚合物。常用的脂质体具有较高的体外转染效率，但体内转染时具有全身毒性。聚合物中几丁糖(Chitosan)和其他聚合物相比，具有相对无毒、生物相容性好、无免疫原性和可被生物降解等特点。由于非病毒载体具有使DNA象药物一样被应用的潜在优势，正越来越多地被推荐替代病毒载体用于体内基因转移。本研究中，首先扩增了携带目的基因的质粒pCDNA3-eNOS，经酶切鉴定和线性化处理，成功地与穿梭质粒pAdTrack-CMV构建了转移质粒pAdTrack-eNOS。再通过细菌内同源重组构建了病毒骨架质粒pAd-CMV-eNOS-CMV-GFP。病毒骨架质粒再经HEK293细胞包装，成为具有感染力的腺病毒载体Ad-eNOS。我们用构建的pAdTrack-CMV-eNOS和几丁糖反应制备几丁糖/质粒复合体，同时构建的携带相同目的基因的腺病毒载体，旨在和CPC进行比较研究。结果表明所构建的第：二军医大学博士论文中文摘要表达质粒pAdTrackCMV七NOS和AdeNOS经酶切鉴定正确连接，同时能够转染HEK293细胞，成功表达了eNOS蛋白。构建Ad－eNOS耗时达三个多月，耗资大。我们使用分子量70kDa的几丁糖，通过提纯，消毒，制成几丁糖的醋酸溶液。根据几了糖分子上的氨基N）数目和质粒DNA分子上磷酸基o）的数目的比值（N／p），和携带编码内皮型一氧化氮合成酶（endothelialnitricoxidesynthase，eNOS）基因的质粒chitosan／pAdTrackCMV－eNOS，通过静电反应形成复合体制备了不同N／P比值的几了糖／质粒复合体（chitosan／PAdTrack－CMV－eNOScomplexes，CPC七NOS）。通过琼脂糖凝胶电泳和透射电镜证实了CPC《NOS的形成。本研究分离培养了SD大鼠原代胸主动脉血管平滑肌细胞，通过荧光显微镜直接观察，FCM检测以及WesternBlot技术，初步研究了CPC－eNOS介导转染体外培养的血管平滑肌细胞的转染效率和影响转染效率的可能因素如pH值，N／P比值和血清浓度。通过析因设计验证pH值和N”比值对转染效率的影响有无交互效应，探索CPC－eNOS体外转染血管平滑肌细胞的优化转染条件。结果表明，转染效率在pH7．0时最高，而pH值过低或过高均不利于转染。不同No比值的CPC．eNOS因表面的物理化学特性不同也影响转染效率。随N［P比值升高，转染效率增高，但N／P比值达6时呈现下降趋势。pH值和N／P比值是影响CPC转染效率的主要因素，但pH值和N厂比值对转染效率的影响无交互效应。转染介质内的血清具有促进平滑肌细胞增殖和提高细胞活力的作用，随血清浓度在一定范围内升高转染效率进一步升高，但血清浓度达到20％时转染效率呈现下降趋势。提示转染和细胞的增殖状态及细胞的活力密切相关。通过直接观察绿色荧光蛋白的荧光、免疫组织化学检查和Westernblot法证明，CPC－eNOS介导的基因转染成功的使目的基因eNOS在体外培养的平滑肌细胞中表达。3％戊巳比妥麻醉家兔，颈部正中切口，仔细分离暴露右侧颈动脉和颈外动脉。使用3F标准球囊导管经颈外动脉，推送至颈总动脉3－4cm，l．satin压力下前送和后撤导管共3次损伤血管内膜。损伤后立即经导管局部灌注CPC－eNOS、Ad．eNOS、裸质粒及生理盐水入隔离血管段内。20分钟后恢复血流灌注，结扎颈外动4第二军医大学博士论文中文摘要脉。家兔复苏后继续饲以高脂饮食，于不同时间点分别处死动物。经HE染色，计算机图像分析，荧光显微镜观察，兔疫组织化学染色和RT－PCR进行分析评价转染和再狭窄预防效果。结果显示，尽管Ad－eNOS抑制再狭窄程度较CPC－eNOS明显（P（0对引，但和裸质粒组