谈补阳还五汤对脑缺血大鼠神经功能及细胞形态的影响论文.docx

谈补阳还五汤对脑缺血大鼠神经功能及细胞形态的影响论文谈补阳还五汤对脑缺血大鼠神经功能及细胞形态的影响论文脑缺血属中风范畴，是临床常见病，具有高发病率、高死亡率及高致残率的特点，严重危害着人类健康。迄今为止，国内外在治疗脑缺血及其后遗症方面还缺少有效的化学治疗药物。循证医学表明，中医药对缺血性脑卒中的治疗有一定优势。当前大量研究集中在中药对急性脑缺血损伤的保护作用。而脑缺血后的功能恢复是一个较长时间过程，目前对其进行较长时间观察的研究较少。出自清代王清任《医林改错》的补阳还五汤，是治疗缺血性中风及中风后遗症的经典名方，该方在临床上应用广泛且疗效确切，但其促神经功能恢复机制还需进一步阐明。本文采用大脑中动脉线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型，探讨了补阳还五汤较长时间多时间点对其神经功能的.保护作用，以期为治疗缺血性脑中风临床用药提供实验依据。1材料1.1动物健康雄性SD大鼠189只，SPF级，体重260～280g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号SCXK(湘)2009-0004，动物合格证号004535。1.2药物补阳还五汤处方来源于清·王清任《医林改错》，按原方组成:黄芪120g，赤芍4.5g，川芎3g，归尾6g，干地龙3g，红花3g，桃仁3g，药材经湖南中医药研究院鉴定均符合《中国药典》2005年版标准。补阳还五汤药剂制备:饮片先用清水浸泡30min，第一煎加药材及5倍体积双蒸水，煎煮60min，二煎5倍体积双蒸水，煎煮60min，两煎混匀，浓缩至含生药2g·mL-1，冷藏待用。1.3试剂10%水合氯醛(扬州市奥鑫助剂厂)，多聚甲醛(长沙市锦华化工有限公司)，TTC(红四氮唑，Sigma公司)。1.4仪器Bx51光学显微镜及IPP5.1图像分析系统(日本Olympus)，FA型电子天平(上海台之衡电子衡器有限公司)，自动双重纯水蒸馏器(上海玻璃仪器一厂)，Finesse325型石蜡切片机(英国Shando)。2方法2.1分组与给药将大鼠随机分为假手术组、模型组和补阳还五汤组，每组63只，每组动物又分3个时间点，即分别于首次给药后7，14，21d处死，每个时间点21只动物。补阳还五汤组动物于术后2h后开始给药，给药剂量为5g·kg-1·d-1，每日ig1次。模型组和假手术组动物均给予等体积蒸馏水。2.2模型制备与评价参照文献采用大脑中动脉线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型:10%水合氯醛(3.5mL·kg-1)ip麻醉，取颈正中切口长约3cm，逐层分离，结扎颈外动脉，夹闭颈内动脉、再结扎颈总动脉，于颈总动脉充盈分叉部下方约4mm处将一长为4cm直径为0.26mm的尼龙鱼线插入颈内动脉，直到遇到轻微阻力为止，固定尼龙线，缝合切口。假手术组仅切开皮肤、分离左侧颈总动脉后随即缝合。术后将动物置于放有清洁垫料的饲养盒内，自由饮水、进食。动物清醒2h后参照Longa及Bederson的5分制法进行神经功能评分，分值在1～3分者入组。0分:无神经损伤症状;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:向对侧转圈;3分:向对侧倾倒;4分:不能自发行走，意识丧失。评分越高，神经功能缺损越严重，反之亦然。不纳入标准:评分低于1分;蛛网膜下腔出血;HE染色无脑缺血病理改变;未到时间点死亡。死亡等不足动物时随机替补。2.3指标检测2.3.1TTC染色测脑梗死面积比每组每个时间点5只大鼠，10%水合氯醛麻醉后，断头取大脑，置于-20℃冷冻20min后，自额极每隔2mm切1片。第1刀在脑前极与视交叉连线中点处;第2刀在视交叉部位;第3刀在漏斗柄部位;第4刀在漏斗柄与后叶尾极之间，共A，B，C，D，E5片。用2%的红四氮唑染色，37℃下避光30min，正常组织呈深红色，而梗死组织则为白色。拍照后选最大缺血断面C片梗死面积，运用Image-ProExpress图像分析系统扫描计算，取梗死面积占C片大脑总面积的百分比表示。为消除梗死侧大脑半球因脑水肿造成的误差，按Swanson方法进行校正后计算C片梗死面积百分比(IS)。IS=(S1-Sr)/2S1×100%S1:C片健侧总面积;Sr:C片患侧非梗死区面积。2.3.2神经功能评分每组每个时间点10只大鼠，于术后2h及动物处死前1h进行神经功能评分。2.3.3HE染色观察海马、皮质组织病理学变化每组每个时间点6只。同2.3.1取大脑后4%多聚甲醛固定24h，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，脑冠状连续切片(片厚5μm)，取含海马切片贴于载玻片上，随后HE染色，光镜下观察比较各组大鼠左侧海马、皮质组织细胞形态病理学改变。2.4统计学分析所有数据以珋x±s表示，应用SPSS19.0统计软件对数据进行统计分析，组间比较用单因素方差分析，P<0.05被认为具有统计学意义。3结果3.1各组脑梗死面积比较通过TTC染色，假手术