讨论补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠血管新生的影响论文.docx

讨论补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠血管新生的影响论文讨论补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠血管新生的影响论文脑缺血后由于脑组织缺血、缺氧引起缺血半暗区神经元变性、坏死,而导致神经功能缺损,因此,尽快恢复缺血区的血液供应对缺血后神经功能的恢复至关重要,而缺血半暗区血流的恢复有赖于侧支循环的建立。血管新生是改善脑组织血流供应的一种有效方法,对中风患者的预后十分关键,是近年来中风研究的热点之一。补阳还五汤是中医治疗缺血性脑损伤的有效经典方剂,前期研究表明,补阳还五汤能显著提高局灶性脑缺血模型大鼠神经功能,增强脑缺血后血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)及其受体Flk1的表达,那么补阳还五汤是否可以促进血管新生进而抗脑缺血损伤?本研究通过免疫组织化学方法观察脑缺血后血管性血友病因子(vonwillebrandfactor,vWF)的表达,探讨脑缺血是否可以诱发缺血周围区的血管新生,以及补阳还五汤是否可以促进脑缺血大鼠缺血区血管新生,为脑缺血后循环重建和功能恢复提供一个新的思路和方法。1材料与方法1.1动物清洁级SD大鼠100只,体重250～300g,雌雄各半,购于上海实验动物中心。1.2药物补阳还五汤处方来源于清·王清任《医林改错》,按原方组成:黄芪120g、赤芍10g、川芎10g、当归尾10g、地龙(研末)10g、红花10g、桃仁10g,中药饮片购自湖南省中医研究院,为同一批药材,经鉴定符合2005年《中国药典》的规定。补阳还五汤传统汤剂制备:传统饮片先用清水浸泡30min,第一煎加药材5倍体积水,煎汁30min,二煎5倍体积水,煎汁30min,两煎混合,每毫克含生药1.5g,置于4℃下冷藏备用。1.3试剂vWF单克隆抗体、罗丹明红(rhodaminered)、异硫氰酸荧光黄(FITC)均购自美国Sigma公司;BrdU单克隆抗体购自美国Chemico公司;重组人血管内皮抑制素(endostatin,ED)购自湖南中医药大学第一附属医院;SABC试剂盒、AEC显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司;TTC(2,3,5-triphenyltetrazoliumchoride)、PBS磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,Ph值7.2～7.4)均购自武汉博士德生物工程有限公司;水合氯醛、双氧水均购自北京鼎国生物工程有限公司。1.4仪器英国Thermo公司E60冰冻切片机;日本Olympus公司BX51光学显微镜及Image-ProPlus5.1(IPP5.1)图像分析系统;上海玻璃仪器一厂自动双重纯水蒸馏器;杭州蓝天化验仪器厂ZD-600电热恒温水浴箱;上海台之衡电子衡器有限公司FA型电子天平。1.5动物分组与给药方法90只大鼠造模成功后随机分为模型组、补阳还五汤组、ED组和补阳还五汤+ED组,另设正常对照组、假手术组各5只,假手术组只打开颈部皮肤,暴露颈部血管后不做其它任何处理即缝合。造模成功动物术后分别存活1、7、14天和28天后处死,每组每个时间点各5只。补阳还五汤组动物于术后苏醒2h后起按4mL/kg,灌服补阳还五汤药液,每日1次;ED组动物于术后按2.5mg/kg腹腔注射ED,前3天每天1次,之后每周2次;补阳还五汤加ED组动物同时进行上述两组动物的操作;上述3组按50mg/kg腹腔注射5-嗅脱氧尿嘧啶核苷进行累积标记,前3天每天1次,之后每周2次,动物若死亡则随机补充。其他各组动物均给予等体积无菌蒸馏水,自由饮食、活动。1.6动物造模采用文献改良的大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血大鼠模型,10%水合氯醛(4mL/kg)腹腔注射麻醉,固定后颈部正中消毒,然后做一长约2.5～3.0cm的切口,钝性分离出右侧颈总动脉,在其远心端分叉处分离出颈内动脉和颈外动脉,结扎颈总动脉和靠近气管的颈外动脉,然后在颈总动脉分叉处近心端作一小切口,将一段一端钝圆的4-0尼龙线由颈总动脉插入至颈内动脉,感觉到有轻微阻力为止,大约进入17.0±0.5mm,然后结扎固定,缝合切口,在切口及周围涂抹抗生素。假手术组仅切开皮肤,分离右侧颈总动脉后即缝合。正常组不做任何特殊处理。手术过程中室温保持在20～30℃并使用加热垫或白炽灯照射。术后将动物放入清洁的饲养盒中,若死亡则随机补充造模。1.7成功模型标准行为学改变表现为动物苏醒后提尾时左侧前肢内收屈曲;同侧Horner征(颈交感神经麻痹综合征:瞳孔缩小、眼睑下垂及眼裂狭小、眼球内陷和患侧额部无汗);爬行时向左划圈;站立时左侧倾倒。TTC染色后梗死区域呈白色,位置在皮层下,大脑的一侧,对侧大脑半球正常脑组织则被染成红色。1.8神经功能评分待清醒2h后按文献的五级评分标准进行神经功能评分,0级:行为无明显变化(0分);1级:左前肢屈曲,左后肢伸展(1分);2级:有左侧追