谈补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤大鼠PTEN mRNA 的影响论文.docx

谈补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤大鼠PTENmRNA的影响论文谈补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤大鼠PTENmRNA的影响论文缺血性脑疾病主要是由于脑血供障碍，脑细胞功能丧失而引起的一系列神经系统功能障碍性疾病。在脑中风事件中，有80%由脑缺血造成中风后神经功能缺失及死亡;在我国，心脑血管病发病率居世界第二，其患病率、死亡率、致残率居高难下，严重影响着人们的生活质量和生活水平。补阳还五汤是目前治疗脑卒中等血栓性疾病应用频率最高的方剂，广泛应用于防治缺血性脑血管病、冠心病、心肌梗死及其他血栓栓塞性疾病。补阳还五汤治疗缺血性脑疾病疗效确切，但其分子机制仍待进一步研究;课题组前期研究发现补阳还五汤具有抗血小板的作用，同时，最新指南推荐在缺血性脑卒中的防治中应用抗血小板药物，而第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)与P-选择素(CD62P)与血小板活化密切相关。因此，本文使用补阳还五汤预处理2周后的SD大鼠复制局灶性脑缺血再灌注模型，测定血浆中血小板活化标记物CD62P含量及海马组织中PTENmRNA表达情况，探讨补阳还五汤对抗脑缺血再灌注损伤的分子机制与血小板活化的关系。1材料1.1动物SPF级SD雄性大鼠60只，体重250～300g，广东省医学实验动物中心提供，合格证号SCXK(粤)2013-0002。1.2药物与制剂硫酸氢氯吡格雷片(赛诺菲制药有限公司，批号2A782)，补阳还五汤颗粒剂水溶液按照《医林改错》所载的药味用量进行制备。处方为:生黄芪120g，当归尾6g，赤芍4.5g，地龙、桃仁、红花、川芎各3g，(黄芪颗粒剂，批号311001T;当归颗粒剂，批号1307117;赤芍颗粒剂，批号309081T;地龙颗粒剂，批号1308206;川芎颗粒剂，批号1308137;桃仁颗粒剂，批号309127T;红花颗粒剂，批号1307190)，取相当于饮片等量的各味药颗粒剂(由广东一方制药有限公司提供)混合后，用100℃蒸馏水配制成补阳还五汤水溶液备用。1.3仪器与试剂ABI7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，Hema9600型基因扩增仪(珠海黑马医学仪器有限公司)，1524R型低温冷冻离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)，JS-power300型电泳仪与培清JS-780型全自动凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司)，K2800型紫外核酸分析仪(北京凯奥科技有限公司)。CD62P试剂盒(华美生物公司，批号CSB-E07399r)，SYBRKPremixExTaqTM(日本TAKARA公司，批号DRR420A)，ReverseTranscriptaseM-MLV试剂盒(日本TAKARA公司，批号D2639A)，Trizol(美国Invitrogen公司，批号10296-010)，CTAB(美国BBI，批号CB0108)，DEPC(美国Sigma公司，批号472565)，琼脂糖(Hydragene，批号R9012TAB)，其余所需试剂由广州化学制剂总厂提供。2方法2.1动物分组使用随机数字表法将60只雄性SD大鼠随机分成5组，每组12只。即假手术组(生理盐水ig)、模型组(生理盐水ig)、氢氯吡格雷组(6.8mg·kg-1·d-1)，补阳还五汤高、低剂量组(26，6.5g·kg-1·d-1)，以上各组所用剂量均参照课题组前期实验;适应性饲养1周后，再按照相应的药物ig给药，每天2次，连续2周。2.2局灶性脑缺血再灌注模型制作大鼠造模参照文献的方法，采用大鼠大脑中动脉线栓法(MCAO)复制局灶性脑缺血模型，并在造模前2h给予相应药物ig。大鼠10%水合氯醛(1.0g·kg-1)ip麻醉后，将大鼠固定于手术操作台上，消毒后其余步骤参照文献进行。假性手术组仅作皮肤切开和血管剥离，不做栓线处理，其余操作同其他组。造模完成后60min拔除栓线，待动物清醒后2h进行神经功能评分。2.3观察指标2.3.1神经行为评分动物于清醒后2h参照文献进行神经行为评分。评分标准如下:0分无神经损伤症状;1分不能完全伸展对侧前爪;2分向对侧转圈;3分向对侧倾倒;4分不能自发行走，意识丧失。2.3.2检测血浆CD62P含量拔除栓线再灌注12h后大鼠经10%水合氯醛ip麻醉(1.0g·kg-1)，眼眶取血约2mL置于真空肝素钠抗凝管中，4℃，3000r·min-1，离心30min，吸取血浆，放置于-20℃冰箱，备测。采用酶联免疫定量检测技术检测大鼠血浆CD62P的含量;操作过程均严格按照试剂说明书进行。2.3.3测定海马组织PTENmRNA表达拔除栓线再灌注12h后大鼠经10%水合氯醛ip麻醉(1.0g·kg-1)，生理盐水灌洗，4%多聚甲醛固定后迅速取脑组织，分离海马，用RNAlater溶液预处理海马组织。Trizol法进行总RNA提取海马组织总RN