乳铁蛋白的分离工艺研究.doc

乳铁蛋白的分离工艺研究牛初乳是指奶牛产犊后3d内所分泌的乳汁。科学研究证实，牛初乳是自然界因子最为富集的生物资源之一。包括重要的免疫因子和生长因子，如免疫球蛋白（IgG）、乳铁蛋白（LF）及胰岛素生长因子（IGF）等，含量比常乳高10～100倍。这些生理活性成分具有免疫调节、延缓衰老、促进生长发育、抑制肿瘤等生物功能，不仅可以制造功能保健食品，而且还具有开发天然活性生物药物的巨大潜力。乳铁蛋白又称“乳转铁蛋白”，是一种糖蛋白，属于转铁蛋白家族。LF的一级结构是一条多肽链，分子量为70～80kD，LF上结合有两条糖链，含量为7%左右，其组成包括有半乳糖、甘露糖、N－乙酰半乳糖胺、藻糖等。LF具有多种生物活性，如促进铁的吸收、抑菌抗病毒、促进细胞增殖、调节骨髓细胞生成、调节补体系统、刺激溶菌酶再生、防止脂质过氧化等。在牛初乳中，乳铁蛋白的含量为1.00mg/ml，比常乳高近50倍。我国约有乳牛近430万头，其中成年母牛260万头，以每头乳牛年产初乳50kg计算，每年可产近130t乳铁蛋白，因此生产乳铁蛋白的原料极为丰富，它的开发利用将带来可观的经济效益和社会效益。但牛初乳具有异味及粘稠度大，难于加工处理的特点，除喂养牛犊之外，利用率非常低。初乳本身所具备的潜在价值得不到充分的反映。因此，高效综合利用牛初乳资源，开发出合理的分离技术路线以提取高纯度、高活性的天然活性蛋白质，特别是开发生物药原料有十分重要的现实意义。本实验室通过离子交换色谱技术，成功地从初乳中分离出了高纯度的乳铁蛋白，并对此分离过程做了适当的优化，达到了低成本分离高纯度乳铁蛋白的目的。1原料与器材1.1原料与试剂牛初乳：乳牛产犊3ｄ内收集的样品，CM-SephadexC-50：进口分装BMK（Shanghai）Sci&TechLtd，CM-SEPHAROSEFASTFLOW，LF标准样品、电泳级丙稀酰胺Acr、电泳级甲叉双丙稀酰胺Bis、分析纯Tris碱（三羟甲基氨基甲烷），化学纯SDS（十二烷基磺酸钠），分析纯TEMED（四甲基乙二胺），过硫酸胺Ap，分析纯甘氨酸，考马斯亮蓝R-250等。1.2实验仪器SBS-100数控计滴自动部分收集器、HD-21-88核酸蛋白检测仪、3057PORTABLERECORDER、BT01-100兰格恒流泵、TH-500梯度混合器、PHS-25型pH计、DYY-8B型稳压稳流电泳仪、DYⅢ28A型电泳槽、751G分光光度计、TDL-5000B冷冻离心机。2实验方法2.1分离方法2.1.1凝胶的预处理取液体胶与去离子水1：1混合，浸泡，沉降装柱。以2BV的流速先用碱洗2.5h（5倍胶体积），用去离子水洗至pH值为7.0左右，用酸洗2.5h，用水洗至pH值为7.0左右，再用碱洗2.5h，后用水洗至pH值7.0左右备用。2.1.2牛初乳的脱脂取新鲜牛初乳在冷冻离心机中离心30min（4800r/min，1～5℃），去上层油脂。2.1.3阶跃洗脱的方法在4℃条件下动态上柱吸附8h。去离子水以1BV的流速洗柱约10h，待基线走平，用1.6%NaCl洗脱约需5h，期间杂蛋白被洗脱下来，待基线再度走平，使用5.0%NaCl洗脱，洗脱产物为LF（粉红色），出峰时间为1h左右。洗脱曲线见图1。2.1.4CM-SEPHAROSEFASTFLOW的穿透曲线（图2）在实验中利用纯度为97%标准样品配制浓度为4.80g/l的LF溶液，在约5BV流速下测定胶体积为62ml的CM-SEPHAROSEFASTFLOW的穿透曲线。根据洗脱记录可计算得到在穿透点到达前，CM-SEPHAROSEFASTFLOW的实际吸附容量为2g左右。2.1.5透析取洗脱液于透析袋，放在蒸馏水中24h，中间每8h换一次水，除去洗脱液中的盐类小分子。2.1.6干燥冷冻干燥法，此法对乳铁蛋白的生物活性损失小。2.2分析方法2.2.1蛋白质测定用核酸蛋白检测仪测定蛋白质。2.2.2乳铁蛋白纯度的分析用HPLC法和凝胶电泳法进行纯度分析。3结果与分析3.1交换剂的选择根据乳铁蛋白的特性，本实验选用弱酸性阳离子交换剂，并选用Na型交换剂作为贮存、吸附时的离子型。比较了CM-SEPHADEXC-50和CM-SEPHAROSEFASTFLOW2种树脂的分离效果。从表1可以看出，相同单位量的牛初乳原料进行实验，CM-SEPHADEXC-50和CM-SEPHAROSEFASTFLOW相比，洗脱得到的LF的量和纯度都相差不大，只是CM-SEPHADEXC-50得到的洗脱液呈较深粉红色，而用CM-SEPHAROSEFASTFLOW洗脱得到的洗脱液颜色略浅一些。使用相同的装柱方法时，CM-SEPHAROSEFASTFLOW比CM-SEPHADEXC-50更容易操作，且在实验过程中体积不会发生变化，有利于实现工业