油茶子饼粕多糖的降血糖活性研究.docx

油茶子饼粕多糖的降血糖活性研究工程有限责任公司;链脲佐菌素（STZ）、胰岛素（INS）ELISA检测试剂盒购自Sigma公司;格列本脲片（2.5mg/片）购自天津太平洋制药有限公司;丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒购自中国南京建成生物研究所;生理盐水购自山东康宁药业有限公司;柠檬酸和柠檬酸钠购自国药集团化学试剂有限公司。1.2方法1.2.1高血糖小鼠模型的建立1）试剂的配制。①柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的配制。精确称取2.1g柠檬酸置于100mL容量瓶中，加入去离子水定容，配制得溶液A;精确称取2.94g柠檬酸钠置于100mL容量瓶中，加入去离子水定容，配制得溶液B。②STZ溶液的配制。分别量取28mL溶液A、22mL溶液B置于100mL容量瓶中，加入去离子水定容，得溶液AB的混合液，即为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH4.5。称取一定量的STZ，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解STZ，使得溶液中STZ浓度为2%。STZ溶液不宜存放，现配现用。2）造模方法。健康雄性昆明小鼠，预分组并标号，保持室温25℃，正常昼夜交替下普通饲料适应饲养一周，随机取15只小鼠，禁食12h（自由饮水），测定空腹血糖值，作为小鼠的基础血糖值。取8只小鼠作空白对照组（NC），正常饲养。剩余小鼠禁食24h（自由饮水），腹腔注射STZ（用前新鲜配制）造模，小鼠120mg/kgBW.ip。5～7d后小鼠禁食12h（自由饮水），尾静脉取血，测定造模小鼠空腹血糖值，血糖值>16.8mmol/L且出现明显“三多一少”症状（即多食、多饮、多尿及体重减轻）的小鼠即为高血糖模型成功的小鼠[19]。1.2.2成模小鼠的分组及给药取造模成功的小鼠40只，随机分为5组，加上正常小鼠的空白对照组，总计6个组，进行每天灌胃试验，灌胃时间持续4周，保持正常昼夜交替，室内温度在25℃，室内通风良好，室内相对湿度维持在45%～65%，小鼠每日正常饮水摄食。第一组（n=8）：正常对照组，正常小鼠，给予正常饮水摄食，灌胃等量生理盐水4周。第二组（n=8）：糖尿病阳性对照组，血糖值>16.8mmol/L，糖尿病成模小鼠，每日给予正常摄食饮水，灌胃等量生理盐水4周。第三组（n=8）：格列本脲阳性对照组，血糖值>16.8mmol/L，糖尿病成模小鼠，每日给予正常摄食饮水，灌胃10mg/（kg·d）格列本脲片4周。第四组（n=8）：多糖低剂量组，血糖值>16.8mmol/L，糖尿病成模小鼠，每日给予正常摄食饮水，灌胃50mg/（kg·d）油茶子饼粕多糖4周。第五组（n=8）：多糖中剂量组，血糖值>16.8mmol/L，糖尿病成模小鼠，每日给予正常摄食饮水，灌胃100mg/（kg·d）油茶子饼粕多糖4周。第六组（n=8）：多糖高剂量组，血糖值>16.8mmol/L，糖尿病成模小鼠，每日给予正常摄食饮水，灌胃200mg/（kg·d）油茶子饼粕多糖4周。1.2.3小鼠各项指数的测定试验过程中，密切观察小鼠的日常行为活动，每周测定并记录各组小鼠的体重，摄食量、饮水量及排尿量，空腹血糖值（测定前禁食12h，不禁水），各脏器指数（小鼠各脏器的重量与小鼠体重的比值[20]）。1.2.4小鼠肝脏、肾脏组织中MDA含量及抗氧化酶活性的测定取小鼠肝脏、肾脏组织块（0.2～1.0g）用冰冷的生理盐水漂洗，滤纸拭干，称重，用量筒量取遇冷的生理盐水，用眼科小剪将组织尽量剪碎，倒入玻璃匀浆管中，充分研磨，使组织匀浆化，制成10%的组织匀浆，离心，取组织匀浆上层清液置于10mL离心管中，于-60℃超低温冰箱冷冻保存备用。按照试剂盒说明书测定各组小鼠肝脏、肾脏组织中MDA、CAT、T-SOD、GSH-Px含量。蛋白质分子基团中含有-NH3+，在蛋白质标准溶液中加入显色剂，-NH3+立刻与棕红色考马斯亮蓝染料中的阴离子结合，溶液呈蓝色，用紫外可见分光光度计在波长595nm处测定其吸光值，由此可计算出小鼠组织中蛋白质含量。1）小鼠肝脏、肾脏匀浆中MDA含量计算公式如下：MDA含量（nmol/mg）=×标准品浓度（10nmol/mL）÷待測样本蛋白浓度（mg/mL）2）小鼠肝脏、肾脏匀浆中CAT活力的计算公式如下：CAT活力（U/mg）=（对照管OD值-测定管OD值）×27÷反应时间（60s）÷[待测蛋白含量（mg/mL）×取样量]3）小鼠肝脏、肾脏匀浆中SOD活力计算公式如下：SOD活力（U/mg）=÷50%×÷组织中蛋白含量（mg/mL）4）小鼠肝脏、肾脏匀浆中GSH-Px酶活力计算公式如下：组织GSH-Px酶活力=×标准品浓度（20μmol/mL）×稀释倍数（5）÷反应时间÷（待测样本蛋白浓度×取样量）5）小鼠肝脏、肾脏匀浆中蛋白质含量的计算公式如下：蛋白浓