抗HBsAg人源抗体Fab片段原核表达的优化.docx

抗HBsAg人源抗体Fab片段原核表达的优化【摘要】目的:优化抗HBsAg人源抗体片段hFabHB1在大肠杆菌中功能性表达的条件。方法:通过测定宿主菌培养物A600值观察10g/L的葡萄糖对宿主菌生长的影响;比较诱导前是否更换培养液的2种不同条件hFabHB1的表达产量;比较在37℃和25℃2种诱导温度下功能性hFabHB1分子的表达量以及Fd和轻链表达的平衡性。大量表达的功能性hFabHB1分子经亲和层析纯化后,用ELISA鉴定其生物活性。结果:在培养液中加入10g/L的葡萄糖可有效抑制重组蛋白的本底表达,增加宿主菌的生长速度;在加入IPTG诱导前更换培养液可明显提高hFabHB1的表达产量;25℃的诱导温度比37℃能表达抗HBsAg人源抗体hFabHB1原核表达优化乙型病毒性肝炎是一类严重危害人体健康的感染性疾病,全球约有亿人感染乙肝病毒,其中近10%的患者可因持续感染导致肝硬化或肝细胞癌[1]。针对HBsAg的中和抗体可阻断乙肝病毒对肝细胞的吸附,从而避免了病毒攻击。目前HBsAg的中和抗体作为免疫治疗剂已在临床上广泛使用,如对HBsAg阳性产妇生产的新生儿进行抗体的被动免疫,以阻断母婴垂直传播;对肝移植的乙肝患者进行抗体的紧急接种来保护移植肝组织免受病毒感染等。但目前使用的抗体均来自人血清,价格贵,来源有限,且存在其他病原体感染的潜在威胁。hFabHB1是通过基因工程技术,从HBV免疫型噬菌体抗体文库中筛选的全人源Fab型抗体片段分子,其靶分子是HBVHBsAg,实验证实hFabHB1可有效阻止HBV与人原代肝细胞的结合,是一个具有潜在临床应用价值的候选分子。但hFabHB1在原核表达系统中存在问题,主要表现在,组成Fab分子的重链Fd段和轻链大多只能以包涵体形式表达,形成有功能的Fab异二聚体分子较少,并且Fd和轻链表达量失衡,轻链大于Fd。本研究对影响hFabHB1功能性表达的各类因素进行优化,如抑制宿主细菌的本底表达、在诱导前更换培养液、降低诱导温度等,使其最终表达产量达到20mg/L。1材料和方法材料重组质粒pComb3xhFabHB1为从噬菌体抗体库中筛出的、能特异性与HBsAg结合的抗体克隆;大肠杆菌表达菌株Top10F′购自Invitrogen公司;ProteinL柱填料购自Pierce公司,HRP标记的山羊抗人IgG抗体购自Sigma公司;HBsAg由深圳康泰股份有限公司赠送。方法葡萄糖对宿主细菌生长的影响重组质粒pComb3xhFabHB1转化Top10F′化学感受态细胞,挑单菌落置10mLLB培养液37℃250r/min培养过夜。次日用50mLLB培养液1∶100稀释过夜培养物,平均分成A、B2份,在A中加入终浓度为10g/L的葡萄糖,B中不加。A、B2份同时在37℃、250r/min培养,每2h测A600值,共培养8h。诱导前更换培养液对表达产量的影响用50mLLB培养液1∶100稀释过夜培养物,平均分成A、B2份,37℃培养约6h至A600值=,对A,1500g离心10min,然后用同等体积的新鲜LB培养液重悬,对B不做处理。在A、B中同时分别加入终浓度为1mmol/L的IPTG,37℃诱导3h。取80μL培养物,加入20μL5×还原型loadingbuffer,100℃煮沸10min。样品经瞬时离心后,每个样品上样5μL行Westernblot,抗体用HRP标记的山羊抗人IgG,比较表达量。温度对hFabHB1分子功能性表达的影响用50mLLB培养液1∶100稀释过夜培养物,37℃培养约6h至A600值=,更换培养液,加入终浓度为1mmol/L的IPTG,平均分成A、B2份,它们分别在37℃和25℃诱导12h。取1mL培养物,10000g离心2min,取80μL表达上清,加入20μL5×非还原型loadingbuffer,混匀,不煮沸。另取80μL表达上清,加入20μL5×还原型loadingbuffer,混匀,100℃煮沸10min。每个样品上样5μL行Westernblot,抗体用HRP标记的山羊抗人IgG,比较重、轻链表达均衡性和功能性hFabHB1表达量。亲和层析大量纯化功能性hFabHB1蛋白用1000mLLB培养液1∶100稀释过夜培养物,37℃培养约6h至A600值=,更换培养液,加入终浓度为1mmol/L的IPTG,25℃诱导过夜。5000g离心20min,分别收集上清和沉淀。调节上清液pH至,过mol/L的微孔滤膜;对于存在于细菌质周腔中功能性蛋白,则在表达沉淀中加入原培养体积50g/L的蔗糖高渗缓冲液,置冰上1h,轻微震荡,30000g离心30min,收集上清液,与表达上清混合。用ProteinL亲和层析柱进行纯化,计算表达产量。纯化的hFabHB1分子分别在还原和非还