大鼠脊髓背根神经节内神经前体细胞的观察.docx

大鼠脊髓背根神经节内神经前体细胞的观察【摘要】目的：探讨大鼠脊髓背根神经节(DRG)内是否存在神经前体细胞.方法：取成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片，进行Brdu,Nestin,P75免疫荧光组织化学检测，分别取成年和胚胎大鼠DRG进行原代细胞培养，观察其增殖与分化情况，并行Nestin免疫组织化学和Brdu,P75,NF,GFAP免疫荧光组织化学鉴定.结果：在成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片上均见有Brdu/Nestin和Nestin/P75免疫荧光双标细胞.细胞培养观察到取自DRG的细胞有分裂增殖，呈Nestin免疫组织化学阳性反应和Brdu,P75免疫荧光组织化学阳性反应；培养第三代细胞加入胎牛血清后出现分化，分化细胞呈NF和GFAP免疫荧光组织化学阳性反应.结论：大鼠DRG内存在有分裂增殖的神经前体细胞，这些细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞.【关键词】大鼠；神经前体细胞；神经节，脊；细胞培养技术；免疫荧光组织化学0引言成年动物的中枢神经系统内存在有神经干细胞已成为公认的事实，这些细胞可以自我更新，分裂增殖，并且向神经元与神经胶质细胞分化［1-2］.NSCs的发现给神经系统损伤的修复带来了希望.随着研究的深入，人们认识到干细胞广泛存在于体内.但外周神经系统是否存在NSCs的研究报道甚少.我们用免疫组织化学和细胞培养的方法观察了成年和胚胎大鼠脊髓背根神经节内神经前体细胞.对哺乳动物外用内神经前体细胞进行了有益的探索.1材料和方法1材料健康孕14d和成年SD大鼠，东南大学医学院实验动物中心提供；细胞培养主要试剂：DMEM/F12(1∶1)，N2，无血清培养液添加剂B27,表皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子,胎牛血清；小鼠抗大鼠NestinmAb,小鼠抗大鼠NFmAb，小鼠抗大鼠BrdUmAb，兔抗大鼠GFAP多克隆抗体;羊抗小鼠SAP试剂盒，BCIP/NBT染色试剂盒;兔抗大鼠P75多克隆抗体，山羊抗小鼠IgG:FITC,山羊抗小鼠IgG:TRITC,山羊抗兔IgG:TRITC.方法切片制备与染色取孕14d和成年大鼠于处死前3d，分别给予BrdUmAb腹腔注射2次(每次50mg/kg).于深麻下，打开胸腔，先后用生理盐水和40g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液进行升主动脉灌注.取出DRG，置于40g/L多聚甲醛内后固定，次日行冰冻切片，片厚15μm.将切片分为三套，分别行HE染色和BrdU/Nestin,P75/Nestin双标免疫荧光组织化学染色.HE染色：DRG切片入苏木精染液染色，水洗玻片上多余染液，10mL/L盐酸乙醇分色.流水冲洗，反蓝.蒸馏水冲洗；1～5g/L伊红染液染色，依次经700,850,1000mL/L乙醇脱水；二甲苯透明，封片.BrdU/Nestin双标免疫荧光组织化学染色：依次加入500mL/L甲酰胺，2×SSC,1mol/L盐酸,1g/L胰蛋白酶及封闭羊血清后，再加入小鼠抗大鼠BrdU抗体，4℃过夜,加入山羊抗小鼠IgG:TRITC，加封闭羊血清，加小鼠抗大鼠Nestin抗体，4℃8h，加山羊抗小鼠IgG:FITC，甘油缓冲液封片.P75/Nestin双标免疫荧光组织化学染色：依次加封闭羊血清，兔抗大鼠P75抗体，4℃过夜，加入山羊抗兔IgG:TRITC，小鼠抗大鼠Nestin抗体，4℃8h，山羊抗小鼠IgG:FITC，甘油缓冲液封片.背根神经节细胞原代培养取孕14d大鼠于麻醉后取出胚鼠,分离出DRG，DMEM液冲洗，剪碎，放在300目的滤网研磨过滤.收集过滤液，离心5min，1000r/min.弃去上清.再次离心后，所得细胞用含有EGF，bFGF的DMEM重悬.将细胞以1×108/L浓度接种于10mL培养瓶内.置于培养箱中培养.取成年大鼠麻醉后，脱颈处死消毒，解剖分离出DRG.将收集到的神经节组织进行原代细胞培养.细胞传代培养在细胞培养到7d时,用g/L的胰酶消化5min,加入100mL/L胎牛血清终止消化，再用吸管吹打成单细胞悬液，离心弃上清，反复两次.所得细胞用前述培养液重悬.将一部分细胞悬液调整成密度为1×108/L，种入新的培养瓶中，继续按照先前条件，置于培养箱培养.另取一部分细胞悬液,用培养液稀释到2×103/L，接种入96孔培养板中,每孔100μL.2h后在倒置显微镜下观察，对只有一个细胞的培养孔做标记.以后每天动态观察标记孔中单细胞的分裂和克隆形成情况.在细胞分裂增殖到一定程度后，按照同样的方法进行第二次传代.培养细胞的鉴定选择第二次传代后有细胞增殖的培养孔，分为三组，前两组分别加入5μmol/L的BrdU,100mL/L胎牛血清，第三组不加任何物质.继续培养3d后,对加入BrdU的培养孔中的细胞进行抗BrdU的免疫荧光组织化学染色.对加入胎牛血清的培养孔的细胞分别进行GFAP,NF的免疫荧光组