大豆异黄酮苷元检测方法的研究.docx

大豆异黄酮苷元检测方法的研究【摘要】目的建立大豆异黄酮苷元含量测定方法。方法采用HPLC法，DiamonsilC18柱(250mm×mm,5μm)，流动相：甲醇-%磷酸溶液，流速mL/min，测定波长260nm,柱温25℃。结果制备的大豆异黄酮苷元总含量为%;大豆苷元、黄豆黄素和染料木素平均回收率分别为%、%和%，RSD分别为%、%和%。结论所建立的测定方法重现性好、可靠，可用于3种大豆异黄酮苷元的含量测定。【关键词】大豆异黄酮苷元；高效液相色谱法；含量测定Abstract:ObjectiveToestablishanHPLCmethodforthecontentdeterminationofisoflavoneaglycones.MethodsIsoflavoneaglyconeswereanalyzedonaDiamonsilC18column(250mm×mm，5μm).Amixtureof%H3PO4，旋转蒸发器(上海亚荣仪器厂)，SH2-D循环水真空泵，电子天平。染料木素、大豆苷元和黄豆黄素对照品(购于上海同田生化技术有限公司,纯度均≥99%)，脱脂豆粕，AB-8大孔树脂，聚酰胺；甲醇(色谱纯,英国TEDIA公司)，屈臣氏蒸馏水，其余试剂均为分析纯。2方法与结果大豆异黄酮苷元的制备取豆粕适量，用8倍量体积分数为70％的乙醇溶液浸泡30min，80℃水浴回流提取2次，每次90min；合并提取液，过滤后回收乙醇、浓缩；上AB-8大孔树脂,以体积分数为50％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，45℃烘干。适量乙醇溶液溶解，拌样上聚酰胺柱，以体积分数为70％的乙醇溶液洗脱，得粗提浸膏，45℃烘干。取一定量的粗提物置于圆底烧瓶中，加入4倍量的7%盐酸-乙醇液，80℃水浴水解2h，浓缩，乙醚萃取，挥干乙醚；用适量体积分数为70％的乙醇溶液溶解，石油醚脱脂，用200～300目硅胶拌匀，自然干燥，上硅胶柱，用三氯甲烷-甲醇洗脱，收集洗脱液，挥去溶剂，得大豆异黄酮苷元混合物［3,4］。样品溶液的制备精密称取大豆异黄酮苷元混合物mg，置50mL量瓶中，加甲醇超声溶解，定容，精密吸取mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得质量浓度为mg/mL的样品溶液。对照品溶液的制备分别精密称定大豆苷元、染料木素对照品mg、mg各置50mL量瓶中，加甲醇超声溶解，定容，得浓度为0mg/mL的大豆苷元及0mg/mL的染料木素对照品溶液；精密称定黄豆黄素mg，置50mL量瓶中，加甲醇超声溶解，定容，精密吸取mL，至5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得0mg/mL的黄豆黄素对照品溶液。4℃储存备用。色谱条件［5～6］DiamonsilC18柱(250mm×mm，5μm)；柱温25℃；流动相：甲醇-%磷酸溶液；流速=mL/min；测定波长260nm；进样量：20μL。线性关系分别精密吸取上述大豆苷元、染料木素、黄豆黄素对照品溶液0.8、、mL置100mL量瓶中，甲醇定容，得混合对照品溶液Ⅰ。同法制备混合对照品溶液Ⅱ-Ⅵ，浓度见表1，混合对照品HPLC色谱图见图1。表1混合对照品溶液中大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的质量浓度Contentsofgenistein,daidzeinandglyciteininthecontrolsampleρ/按上述色谱条件依法测定，分别以大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的浓度(μg/mL)对峰面积作回归计算,得回归方程分别为：y=+，r=；y=+，r=；y=+，r=。大豆苷元、黄豆黄素和染料木素分别在～μg/mL，0～0μg/mL,～μg/mL范围内，线性关系良好。大豆苷元2.黄豆黄素3.染料木素图1对照品HPLC色谱图HPLCchromatogramofreferencesubstance精密度试验取对照品溶液Ⅲ，重复进样6次，记录色谱图，测定峰面积值，计算RSD值，得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的RSD分别为９%、２%和３%。重复性试验取同一批次大豆异黄酮苷元混合物6份，按“”项下，制备样品溶液，测定峰面积值，计算RSD值，得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的RSD分别为%，%和%。稳定性试验取同一样品溶液分别在0、2、4、6、8、12h于上述色谱条件下测定峰面积值，计算RSD值，得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的RSD分别为%、%和%。回收率试验取大豆异黄酮苷元混合物6份，精密称定，分别准确加入3种对照品溶液各适量，余同“”项下操作。分别计算得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素平均回收率，结果见表2、表3、表4,结果表明，3种苷元回收率均符合要求。大豆异黄酮苷元含量测定精密吸取样品溶液，测定3次，结果见表3,样品中３种苷元总质量分数为%,样品HPLC图见图2。表2大豆苷元加样回收率实验结果Recoveryresultsofdaidzei