半夏组织培养物中生物碱含量的研究.docx

半夏组织培养物中生物碱含量的研究【摘要】目的探讨不同激素种类和配比的培养基对半夏培养物生物碱合成的影响，为提高半夏有效成分在植物体内的富集提供理论依据。方法采用氯仿提取，依据酸性染料比色法的原理，在417nm波长下测定，并作方差分析。结果获得良好的线性关系(r=9)和回收率(%)，RSD为%。MS+mg/mlNAA+/mlKT培养基最适合半夏培养物生物碱的积累，平均高达2%，不含2，4-D的培养基所诱导的愈伤和分化出的不定芽、不定根、再生块茎所产生的生物碱明显高于含有2，4-D的培养基所诱导的愈伤组织和分化出的不定芽、不定根、再生块茎所产生的生物碱。结论激素种类和配比对半夏组织培养物中生物碱含量的影响较大。【关键词】半夏;组织培养物;生物碱中药半夏为天南星科多年生草本植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Brt的干燥块茎，在我国大部分地区及朝鲜半岛和日本均有分布。半夏入药首载于《神农本草经》《中国药典》2005年版收载为唯一的半夏类药材植物。半夏块茎主要含有生物碱、β-谷甾醇、多糖、半夏蛋白、氨基酸、挥发油及无机元素等多种化学成分，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之功效。目前市售镇咳类中药复方制剂中多含有半夏，而生物碱在众多的化学成分中具有明显的生物活性和生理功能，是中药半夏中主要有效成分之一。近年来，由于配方、成方制剂中原料的需求和出口的增加，加上耕作技术的改变和常年采挖，半夏野生资源逐渐减少，已经多年不能满足市场需要。为了满足国内外市场对半夏的需求，给国内外市场提供优质无公害的绿色半夏药材，本研究通过探讨不同激素种类和配比的培养基对半夏培养物生物碱的合成的影响，为中药半夏生产提供理论依据。1材料与仪器样品材料来自西华师范大学生命科学学院半夏试验基地的半夏块茎，常规消毒后接种在MS培养基上，附加不同浓度的2,4-D、KT、NNA，在人工气候箱中培养，培养温度25℃，培养96d后选取生长旺盛的愈伤组织和分化出的不定芽、不定根、再生块茎按培养基的不同配比分别收集，洗净培养基，105℃烘箱中烘4h后于60℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后过60目筛置干燥器备用。试剂对照品盐酸麻黄碱(中国药品生物制品检定所，批号：714-9903);氨水、二氯甲烷、柠檬酸钠缓冲液(pH=6.0)，0.1%溴麝香草酚蓝溶液等均为市售分析纯。仪器GT3C916紫外-可见分光光度计(澳大利亚GBC科学仪器有限公司);旋转式蒸发仪(上海申科电子有限公司)。2方法和结果对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的盐酸麻黄碱对照品16.4mg，置250ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制得含盐酸麻黄碱浓度为0.0656mg/ml对照品溶液。样品供试液的制备精密称取样品粉末，加入12%氨水将材料搅拌至湿润，加入样品量18倍的氯仿浸泡25h，置70℃水浴锅中回流提取5h，过滤，残渣以10ml氯仿分3次洗涤，合并提取液，移至50ml容量瓶中，用氯仿稀释至刻度，摇匀，精确吸取提取液2ml置旋转式蒸发仪浓缩至干，加入pH6.0缓冲液5ml，精密加入氯仿10ml，加0.1%溴麝香草酚蓝溶液1ml，充分振荡，移至60ml分液漏斗，静置0.5h.，分取氯仿层，作为样品供试液。2.3实验条件的选择最大吸收光谱波长的选择精密称取样品，按“2.2”项方法制备样品供试液，并将对照品溶液和样品供试液在380～600nm波长范围内进行光谱扫描，结果两者在417nm波长处均有最大吸收值，二者的吸收峰完全相同，吸收光谱一致，故选定417nm作为测定波长。见1。稳定性考察精密称取样品，按“2.2”项制备样品供试液和空白对照液，在波长417nm处进行测定，并在室温下每隔20min测定1次，实验结果表明供试样品液在80min内显色稳定，RSD=0.3%(n=5)。本实验只考察了80min内供试液的显色稳定性，因80min内完全可以完成测定。图1样品和对照品的可见-紫外吸收光谱标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液0.1，0.3，0.5，0.7，0.9ml，分别加蒸馏水至1.0ml，加入5mlpH6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，精密加入氯仿10ml和0.1%溴麝香草酚蓝溶液1ml充分振荡，移至60ml分液漏斗，静置0.5h，分取氯仿层，制得对照品供试液。另取1ml水，以同样方法操作，作空白对照液，在417nm波长处测定吸光值。以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，求得回归方程为：Y=6X+5,r=0.9989(n=5)，表明盐酸麻黄碱在0.39～3.47μg范围内与吸收度呈良好的线性关系，符合Beer定律。精密度与回收率考察精密度精密吸取0.7ml对照品溶液，按“2.2”项制备对照品供试液和空白对照液，在417nm处连续测定吸收度5次，RSD=0.06%，表明仪器有较好的精密度。回收率取样品粉