Survivin基因真核表达载体的构建及其在cos.docx

Survivin基因真核表达载体的构建及其在cos【摘要】［目的］克隆人survivin基因并在真核细胞中表达。［方法］以人喉癌组织中提取总RNA为模版，采用反转录聚合酶链RT-PCR法获得survivincDNA。将该基因克隆到载体中,构建真核细胞表达载体/survivin，将测序正确的survivin基因通过脂质体介导下转染cos-7，Westernblot检测survivin蛋白在cos-7中表达。［结果］DNA测序证明获得了survivin基因，其序列与GeneBank中报道序列完全一致。Westernblot检测survivin蛋白获得高效表达，其相对分子质量为。［结论］Survivin基因的克隆和表达均获得了成功，为进一步探讨survivin基因在喉癌诊治中应用奠定了基础。【关键词】survivin基因人喉癌组织基因表达ConstructionofSurvivinEukaryoticExpressionVectorandItsExpressionincos-7Abstract:［Purpose］Tocloneandexpresshumansurvivingenewitheukaryoticvector.［Methods］TotalmRNAwasextractedfromhumanlaryngealcancertissue,andthenthefull-lengthsurvivincDNAwasobtainedbyRT-PCR.Thesurivingenewasclonedintovectorandthe/survivinvectorwasconstructedandtransfectedintocos-7cells.Thesurvivinproteinwasanalyzedbywesternblot.［Results］ThecDNAofsurvivinwassequencedandconsistentwiththesequencereportedinGenebankwithblast。Westernblotanalysisdemonstratedthatthesurvivinproteinwasexpressedandtherelativedmolecularmasswasabout［Conclusions］survivingenehasbeenclonedandexpressedsuccessfullyandcanbeusedforfurtherstudytheapplicationsofsurvivinondiagnosisandtherapyinthelaryngealcancer.Keywords:survivingene;eukaryoticexpression;vectorconstructionSurvivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins，IAP)家族的成员，其功能主要通过抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻断细胞凋亡过程。该蛋白选择性地表达于胚胎发育组织和人类大多数肿瘤组织，而正常成人终末组织中不表达，其独特的分布特点在肿瘤发生、发展过程中的重要作用已受到学者们的广泛关注。为了进一步探讨该基因在人喉癌组织中的表达及其在喉癌诊断及预后判断中的作用，我们构建了survivin基因的真核表达载体并将其转染cos-7细胞以观察该基因在其中的表达情况，为下一步喉癌的诊断和治疗提供新的理论依据。1材料与方法材料人新鲜喉癌组织、质粒和猴成纤维细胞cos-7细胞系及DH5α菌株均为本科保存。限制性内切酶及胰蛋白酶购于宝生物工程(大连)有限公司；T4DNA连接酶、DNA纯化试剂盒和逆转录试剂盒购于Promega公司，用于组织总RNA提取的TripureIsolationReagent提取试剂盒购于Gibco公司。转染试剂LipofectamineReagent2000和G418购于Gibco公司，survivin兔抗人多克隆抗体购自于Santacruz公司。方法PCR引物设计根据GeneBank中survivin序列，设计一对引物，P1(survivin基因上游引物，5′GCCGGTACCATGGGTGCCCCGACG；3′P2(survivin基因下游引物，5′GCCCTCGAGTCAATCCATGGCAGC3′。在上游和下游引物5′端分别加入了BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，以便于克隆。引物由上海博亚生物有限公司合成。目的基因survivin片段的获得取手术切除的人新鲜喉癌组织，机械捣碎后，消化收集、洗涤、沉淀，以TripureIsolationReagent总RNA试剂提取总RNA(详见试剂操作说明)，按产品说明书操作，以反转录体系经RT-P