Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和测序.docx

Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和测序【摘要】目的：利用RNA干扰(RNAi)技术，以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体，并进行测序鉴定.方法：设计具有短发夹结构的两条DNA序列，经退火成互补双链，再克隆至载体中构建重组表达载体，转化DH5α菌株，提取质粒行酶切鉴定后，并进行序列测定.结果：将合成的DNA序列退火后克隆到载体上，经酶切和测序鉴定确实为所需序列.结论：Survivin靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功，可利用所得的小RNA序列干扰survivin基因的mRNA转录，供抗肿瘤研究参考.【关键词】survivin基因；RNA干扰；重组表达载体0引言RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是近几年发展起来的新技术.用小片段RNA二聚体(smallinterferingRNA,siRNA)对高等哺乳动物细胞进行转导，成功排除了长片段双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)在哺乳动物细胞内引起非特异性干扰的现象，但其主要障碍是长于30nt的双链RNA将激活抗病毒机制，导致非特异性的RNA转录降解.而体外合成21nt的siRNA能够成功地特异性抑制哺乳动物的基因表达［1-3］.本实验我们针对凋亡抑制蛋白(inhibitionapoptosisprotein,IAP)基因家族的survivin基因的短发夹结构RNA(smallhairpinRNA,shRNA)构建重组表达载体，为体外和体内抗肿瘤研究提供平台.1材料和方法材料含有人H1启动子的pSilencer质粒为美国Ambion公司产品，由西南医院皮肤科王继文博士赠送.克隆用大肠杆菌DH5α由本校烧伤科实验室董征学硕士赠送.限制性内切酶BamHⅠ,HindⅢ及T4DNA连接酶、核酸分子质量标准λHindⅢdigest,DL2000均为TaKaRa公司产品.质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒均为美国Omega公司产品.方法基因干扰片段shRNA的设计与合成氯化钙法制备DH5α大肠杆菌感受态细胞冻存于-70℃备用；扩增和纯化质粒根据Genbank中报道的survivin基因核苷酸序列(NoNM001168)，参考shRNA设计原则进行设计［4］，最后选择出三条片段作为survivin基因干扰片段.以间隔序列连接干扰片段正向和反向序列，两端加酶切位点，最后得到具有回文结构和发夹结构(hairpinsiRNA)的干扰片段序列，并将其送北京赛百盛生物试剂公司合成.表达载体的构建将每对要退火的两条片段分别取2μL与46μL退火缓冲液混合，利用PCR仪加热至95℃3min，然后70℃水浴,自然冷却至室温.用45μL的无酶去离子水稀释5μL的退火双链，使其终浓度为8mg/L.载体经BamHⅠ和HindⅢ双酶切.将退火片段与经酶切后的载体按摩尔比3∶1的比例进行连接反应，同时设立阴性对照和质粒的阳性对照反应，置16℃过夜.将连接产物各取4μL分别接种于100μL的DH5α感受态细胞中进行转化.挑取单菌落扩增培养，质粒小量抽提试剂盒进行质粒试抽提.用限制性内切酶BglⅡ分别对重组质粒进行单酶切(此位点为目的序列所特有的酶切位点)鉴定.得到的重组质粒分别命名为,,重组质粒测序鉴定将鉴定证实后的三个重组质粒各取1管菌液送大连宝生物工程有限公司测序.所用引物为M13+.2结果载体双酶切鉴定回收酶切产物行12g/L琼脂糖凝胶电泳后，可见环状质粒已被切开,大片段约为kb，小片段为61bp因太小而无法检测.筛选重组质粒，pSilencer，pSilencer培养板上均有细菌克隆长出，形态和大小基本一致；质粒的阳性转化对照有大量细菌克隆长出；阴性对照培养板上无细菌克隆长出，连接转化可能成功.单酶切鉴定重组质粒第2孔经BglⅡ单酶切的，因该质粒无此酶切位点故仍保持环状结构；第4，6，8孔为经BglⅡ单酶切的三个重组质粒，因该重组质粒含有此酶切位点故可被酶切成线状结构.重组质粒测序鉴定测序结果均包含目的序列(图3）.3讨论肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病，同时也是凋亡异常的疾病.肿瘤中细胞凋亡现象很可能是机体对抗肿瘤的主动措施，因此细胞凋亡在肿瘤的发生发展及治疗中起着关键性的作用.细胞凋亡(apoptosis)受多个基因的凋控，抑制凋亡的基因主要包括bcl2基因家族和IAP家族.其中，survivin基因是IAP基因家族的新成员.1997年Ambrosini等［5］利用效应细胞蛋白酶受体1cDNA在人类基因组文库中筛选克隆得到的新基因.SurvivinN端含有一个杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列(BIR)分子，其中含有对抑制凋亡有重要作用的氨基酸残基Trp67，Pro33和Cys84，survivin通过这些氨基酸残基与Caspase3和Caspa