柴胡疏肝散抗肝纤维化的实验研究.docx

柴胡疏肝散抗肝纤维化的实验研究【摘要】目的探讨柴胡疏肝散对肝纤维化大鼠模型αSMA、TGFβ1的影响及其抗纤维化的机制。方法采用40%CCl4皮下注射，制备肝纤维化模型并以柴胡疏肝散干预，测定肝功能、血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)及肝组织羟脯氨酸(HYP)，光镜观察肝组织病理变化，免疫组织化学法检测肝组织αSMA、TGFβ1表达，RTPCR检测TGFβ1mRNA的表达。结果柴胡疏肝散组较模型组:肝功能明显改善，血清HA及LN显着降低，肝组织HYP含量明显少，肝组织纤维化程度明显改善，肝组织αSMA及TGFβ1表达减少。结论柴胡疏肝散对CCl4诱导的大鼠肝纤维化有良好的防治作用。【关键词】柴胡疏肝散；肝纤维化；αSMA；TGFβ1近年来柴胡疏肝散抗肝纤维化的临床研究取得了较好的临床效果〔1〕，但目前国内外尚无柴胡疏肝散抗肝纤维化的基础研究。本实验采用四氯化碳(CCl4)大鼠肝纤维化模型,观察柴胡疏肝散的抗肝纤维化作用,并探讨其对α平滑肌肌动蛋白(αSMA)、转化生长因子(TGFβ1)影响及柴胡疏肝散抗肝纤维化的理论机制。1材料与方法11材料111动物及药物雄性22月龄Wistar大鼠60只,体重300～350g，由吉林大学实验动物中心提供。柴胡疏肝散(柴胡6g，陈皮6g，川芎5g，香附5g，枳壳5g，赤芍5g，甘草3g，由长春中医药大学附属医院提供)经冷水浸泡药材2h，常规两煎,头煎15h，二煎1h，两次水煎液混合并过滤,经水浴蒸发浓缩成含生药112g/ml的浓缩药液冷藏备用。按体表面积折算,大鼠每天的柴胡疏肝散等效剂量为28g/kg(体重)。112药品及试剂CCl4购自北京北化精细化学品有限责任公司)；秋水仙碱(colchicine)购自昆明股份制药有限公司;谷丙转氨酶、谷草转氨酶试剂盒购自上海科欣生物技术研究所；血清总胆红素(TBIL)试剂盒购自上海科华东菱诊断用品有限公司；透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)放射免疫分析测定盒购自上海海军医学研究所生物技术中心；单克隆急用型鼠抗人生αSMA试剂盒购自北京中杉生物公司，兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，即用型SP免疫组化试剂盒购自福州迈新试剂公司，DAB购自北京中山生物公司，RTPCR两步法试剂盒购自TAKARA公司，Trizol购自Sangon公司。12方法121模型制作参照文献〔2〕方法：实验第1天除正常空白对照组(对照组)外,其余动物皮下注射CCl4分析纯05ml/100g(体重),以后每隔3d注射40%CCl4橄榄油剂03ml/100g(体重),连续8w。实验前2w饲喂高脂玉米粉饲料(795%玉米粉+20%猪油+05%胆固醇)，第3～6周饲喂100%玉米粉和30%乙醇饮料。122分组及给药方法将60只大鼠随机分为4组,每组15只，第1组对照组,饲喂正常饮食;第2组模型组,按上述造模方法给予饮食;第3组柴胡疏肝散治疗组,于造模3w开始,给予柴胡疏肝散煎剂灌胃,每日28g/kg;第4组秋水仙碱组，于造模3w开始给予秋水仙碱01mg/(kg·d)-1，共8w。123标本制作上述造模及处理过程结束日，禁食12h后称质量，股静脉取血，分离血清置-20℃保存;并立刻完整摘取肝脏及脾脏，称质量后用生理盐水漂洗肝左叶数次，滤纸拭干后，切取02g置于冰浴中的组织匀浆器内，加入冰生理盐水2ml，制备成100g/L肝组织匀浆，4000r/min4℃离心，取上清液保存于-20℃。肝右叶置于40g/L中性甲醛液中常规固定后，石蜡包埋，用于制作组织芯片。13检测指标131血清及组织纤维化指标检测测定血清肝功能包括总胆红素(TBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、A/G，检测透明质酸(HA)，Ⅲ型前胶原(PCⅢ)，N型胶原(CN)，层黏蛋白(LN)含量(放射免疫分析法):肝匀浆检测羟脯氨酸(HYP)含量(二甲氨基苯甲醛法)，检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，均按试剂盒说明书操作。132病理检测组织芯片分别行常规HE染色，Masson三色染色(染胶原纤维)及网织纤维染色，光镜下观察，并根据王泰龄等改进的肝纤维化半定量评分系统(SSS)〔3〕进行炎症活动度及肝纤维化程度计分。133免疫组织化学检查αSMA、TGFβ1采用石蜡包埋常规切片,SP法,兔抗鼠TGFβ1,多克隆抗体及鼠抗鼠αSMA单克隆抗体均以1∶100稀释,DAB显色,苏木素复染。PBS代替一抗作为阴性对照。阳性组织呈棕色，阴性组织呈蓝色在全自动图像分析系统上，采用HPIAS2000型图像分析软件进行定量分析，随机选取每张切片10个视野(×400)倍测定阳性细胞的A值与所占视野面积，取