孔石莼抗病毒蛋白多糖的提取分离及抗柯萨奇病毒B3活性.docx

孔石莼抗病毒蛋白多糖的提取分离及抗柯萨奇病毒B3活性【摘要】目的从绿藻孔石莼中分离具有抗病毒活性蛋白多糖提取物。方法新鲜孔石莼经pH的磷酸盐缓冲液提取和硫酸铵沉淀得到粗提取物，大孔树脂层析分离得到蛋白多糖。经紫外扫描、高温高压处理和糖苷酶水解测定提取物的性质。MTT法检测蛋白多糖对Hela细胞的毒性，细胞病变法检测蛋白对柯萨奇病毒B3引起的细胞病变抑制作用。通过样品对细胞的保护作用、对CVB3增殖的影响、对CVB3感染细胞的综合作用，初步研究了样品抗病毒作用的机理。结果从孔石莼中提取了蛋白多糖，得率为%。毒性试验结果表明，孔石莼蛋白多糖对HeLa细胞的半数中毒浓度TC50大于8mg·ml-1。孔石莼蛋白多糖具有显着的抗CVB3活性，通过试验测得孔石莼蛋白多糖对CVB3主要是预防作用和直接杀灭作用，其IC50为μg·ml-1。结论从孔石莼中分离到具有抗病毒活性的蛋白多糖，具有很好的抗CVB3活性。【关键词】孔石莼；提取；纯化；孔石莼蛋白多糖；抗病毒活性；CVB3Abstract：ObjectiveToisolateantivirusproteoglycanfromthegreenalgae,Ulvapertusa.MethodsFreshUlvapertusawasextractedbyphosphatebuffer,andthetotalprotnwasprecipitatedwithammoniumsulfateandthenpurifiedbymacroporousresin.Thetoxicityandantiviralbioactivitywereevaluatedbycytopathiceffect(CPE)andMTTcolorimetricassay.ResultsTheTC50(50%toxicityconcentration)ofproteoglycanpurifiedfromUlvalactucaL.ismorethan8000μg·ml–1andtheIC50((50%inhibitoryconcentration)inhibitoryconcentration)wasμg·ml–1，TIwas2antiviralprotnsfromtheUlvalactucaL.exhibitspotentanti-CVB3activityinvitro.Keywords：UlvalactucaL.；Extract;Purify;Antiviraleffect;ProteoglycanfromUlvalactucaL;CoxsackievirusB3(CVB3)柯萨奇病毒B(coxsackievirusB，CVB)属小核糖核酸科肠道病毒属，是引起病毒性心肌炎最主要的病原体，其中以CVB3对心肌的亲和力最强，可导致心律失常，急、慢性心功能不全，扩张性心肌病甚至猝死，严重威胁人类健康［1］。柯萨奇B3病毒是典型的溶细胞病毒，目前尚无理想有效的药物。常用病毒唑作为治疗药物，但存在毒性较大，常出现白细胞减少、头痛、不可逆贫血、血清胆红素升高、致畸等副作用。因此筛选、研制新的抗CVB3药物就显得尤为重要。近年来，病毒感染性疾病呈现快速上升的趋势，而且新病毒种类不断出现，但长期以来抗病毒的药物缓慢。陆地生物药源越来越少，海洋生物为抗病毒新药的发现提供了广阔资源。第一个抗病毒海洋药物为阿糖胞苷(Ara-C，Cytara-bine)，在1955年被美国FDA批准用于治疗人眼单纯疱疹病毒［2］。海洋药物学的迅速发展，为药学研究开辟了广阔的前景，目前了解到红藻和褐藻具有很多抗病毒、抗菌、增强抵抗力和提高免疫力等的生物活性作用［3］，但绿藻研究方面比较少；孔石莼是海藻中蛋白质含量最高的一种藻体，本文初步研究了从孔石莼中提取蛋白多糖的方法，并研究了孔石莼蛋白多糖抗病毒活性及其初步作用机制。目前海藻多糖抗病毒报道较多，但少见关于海藻糖蛋白或者蛋白多糖抗病毒的报道，本文从含蛋白质丰富的绿藻孔石莼中提取到具有抗病毒活性的蛋白多糖。1材料与仪器材料新鲜孔石莼：广东湛江南海海域，-70℃保存。自来水反复冲洗，以除去泥沙和盐分等杂质，蒸馏水洗3次，阴干表面的水分。试剂与仪器浓硫酸，浓盐酸，氯化钡，硫酸铵，氯化钠，氯化钾，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，硫酸钾等，以上试剂均为广州化学试剂厂分析纯。DMEM培养基(Hyclone公司)；CO2培养箱(日本Sanyo公司)；超净台(苏州净化设备公司)；相差显微镜(德国Laica公司)；酶标仪(美国BIO-RAD公司)；MTTSigma公司产品。细胞株和病毒Hela细胞株引自美国ATCC公司，由本室保存。细胞生长液为含10%新生小牛血清的DMEM，细胞维持液为含2%新生小牛血清的DMEM，常规加入青霉素100U·ml-1